细胞化学检测法

一、四唑盐(MTT)比色法

检测细胞存活和生长的方法除前面所介绍的方法外，还可用四唑盐比色试验(MTT)。由于这种方法与细胞计数法、软琼脂克隆形成试验和3H-TdR掺入试验有良好的相关性，且灵敏度高、重复性好、无放射性污染等，所以常用于细胞活力的检测。此法的主要原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测，以在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。此法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、抗肿瘤药物的筛选、细胞毒性试验和肿瘤放射敏感性的测定等。

基本步骤：

（1）用0.25%胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成1×109细胞/L的单细胞悬液，将细胞接种于96孔培养板中，每孔100μL。

(2)将培养板置CO2孵箱中，在37℃ 5% CO2条件下，培养3～5天(根据实验目的而定)。

(3)培养3～5天后，每孔加入MTT溶液(将MTT按5mg/mL溶于0.01mol/L，pH7.2的PBS中，轻轻吹打至全部溶解，过滤除菌，4℃避光保存，保存时间一般不超过两周)10μL，继续置培养箱孵育3～6小时，终止培养，加10%SDS-HCl 100μL/孔37°C数小时，将细胞内和细胞周围的MTT一甲月赞  颗粒充分溶解。

（4）用酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值(OD)，选波长490nm。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。

用此法测细胞活力，为保证结果的准确性，最好在试验前测定每种细胞的贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，再确定每孔细胞接种数和培养时间，以保证培养终止时不至过满。另外，试验时应设空白对照，比色时，以空白孔调零。

二、细胞蛋白质含量测定法(考马斯亮蓝测定法)

此法基本原理是：考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合，在595nm波长处呈最大吸收，其光吸收值与蛋白质含量呈正相关。此法主要用于测定酶、受体及细胞外代谢产物特异性活性的度量单位。

基本步骤：

（1）用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成悬液，用10%胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为1×104细胞/mL，接种于24孔培养板，每孔1mL，置37℃ 5%CO2条件下培养一定时间。

（2）用胰蛋白酶消化分散，培养板的细胞悬浮在PBS中，计数细胞数，取106细胞以1000r/min离心5分钟，弃上清液，加0.5ml 0.1%SDS或0.3mol/L NaOH，置100℃煮3分钟，使细胞裂解。

（3）取0.1mL考马斯亮蓝染液与100μL上述细胞裂解液混匀，放置10分钟。

（4）用可见光分光光度计在595nm波长处测定溶液的光吸收值。以溶剂为空白对照，以已知量的牛血清蛋白蛋白（BSA1～50μg）为标准品，绘制标准曲线。然后根据标准曲线推算样品中蛋白质含量。

三、细胞蛋白质合成的3H-亮氨酸掺入试验

此法的基本原理是，细胞在合成蛋白质时需摄取外源性氨基酸，用同位素标记氨基酸如3H-亮氨酸可以掺入细胞蛋白质合成代谢中，通过测定细胞的放射性强度，可了解细胞蛋白质合成代谢状况。

基本步骤：

（1）取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，调整细胞密度至107～109/L，接种于24孔培养板，每孔1mL。

（2）将培养板置37℃ 5% CO2孵箱中培养至细胞处于对数生长期时，每孔加100μL预温37℃的3H-亮氨酸(终浓度为1.85×108Bq/mL)。

（3）继续培养4～24小时(根据预先摸索的掺入时间定)。

（4）终止培养，取出培养板，小心吸出培养上清液，用预冷的PBS小心洗涤，晾干。如果细胞松散，可先用甲醇固定10分钟。

（5）把培养板放在冰盖上，每孔加1mL 10%三氯醋酸(TCA)，在4℃放置10分钟，吸取上清液。

（6）用甲醇洗涤、晾干。

（7）每孔加0.5mL 10.3mol/L NaOH，1% SDS,室温下放置30分钟。

（8）混匀、移入闪烁瓶中，加5mL闪烁液，用液体闪烁计数仪测定每分脉冲数(cpm)，以cpm/106细胞或cpm/mg蛋白表示。

对悬浮生长的细胞则采用离心法处理。

四、细胞DNA合成测定

(一)3H-TdR掺入法

此法的基本原理是：胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质，。用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。

基本步骤：

（1）取对数生长期细胞，制成3×108细胞/L的细胞悬液，接种于24孔培养板中，每孔1mL。

（2）将培养板放入37℃ 5%CO2孵箱中培养24小时左右。

（3）在细胞处于对数生长期时，每孔加入100μL 3H-TdR(用HBSS配制3.7×108Bq/mL浓度，过滤除菌)，使终浓度为3.7×107Bq/mL。

（4）继续培养1～24小时(根据实验要求确定)。

（5）终止培养，小心吸弃培养上清液，用HBSS漂洗单层细胞2次，然后加2mL预冷的10%TCA(三氯醋酸)，放置10分钟。如果细胞松散，应先用甲醇固定10分钟。再用10%TCA重复洗2次，每次5分钟。

（6）每孔加0.5mL 0.3mol/L NaOH,在60℃处理30分钟，然后使之冷至室温。

（7）收集上述裂解液，移入闪烁瓶中，加5mL闪烁液，用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数(cpm),结果以cpm/106细胞表示。

(二)流式细胞仪测定DNA合成

用流式细胞仪测定细胞增殖同期和DNA合成是90年代发展起来的新手段，不仅快速、准确、效果好，而且消除同位素标记的许多繁琐方法和放射性污染。

基本检测程序：

（1）取80%至接近汇合的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制备成单细胞悬液，细胞密度1×109细胞/L，注意不能留有细胞碎片。

（2）进行流式仪检测。除检测细胞周期时相变化和反应DNA合成情况外，还可了解染色体倍性；结合荧光免疫法，还可对细胞膜进行分析等。