小鼠脑微血管内皮细胞的体外培养

摘要: 　目的　探讨脑微血管内皮细胞的体外培养方法并进行细胞超微结构研究及组织型纤溶酶原激活物(TPA ) 活性测定。　方法　取新生小鼠脑组织, 通过匀浆、过筛、胶原酶消化、差速粘附等技术对鼠脑微血管内皮细胞进行原代培养, 待细胞铺满瓶底时, 用01125%胰酶20102%EDTA 消化, 离心收集内皮细胞, 进行传代培养。原代、传代各取8 例, 吸取培养液用酶联免疫吸附试验测试TPA 活性。　结果　经Ð 因子相关抗原免疫组织化学鉴定、细胞超微结构观察, 证明培养的是血管内皮细胞。培养的脑微血管内皮细胞能合成分泌TPA。　结论　鼠脑微血管内皮细胞的培养为体外研究脑血管疾病提供了可靠的手段。

关键词: 　微血管内皮细胞; 细胞培养; 超微结构; 组织型纤溶酶原激活物; 小鼠

通常认为, 脑微血管内皮细胞主要参与构成血脑屏障保护脑。近年来研究表明, 内皮细胞不仅是屏障和半透膜, 还是重要的代谢和内分泌器官。它可以合成、释放血管紧张素(ACE)、白细胞介素( IL 21、IL 22、IL 23)、五羟色胺(52HT )、组织型纤溶酶原激活物(TPA ) 等多种因子。血管内皮是人体最大的内分泌腺, 几乎所有的器官组织都受其调节和影响[ 1 ]。因此, 体外内皮细胞的培养、超微结构的观察及生物活性的测定, 能为脑血管疾病的进一步研究积累资料。

1.材料与方法

参照已有的脑微血管内皮细胞培养方法[ 2～ 4 ] ,进行细胞培养。以直接取自生物体细胞、组织和器官开始的培养称为原代培养; 不论是否稀释, 当原代细胞铺满瓶底时, 将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养[ 5 ]。

1.1 原代培养　新生小鼠(福建医科大学实验动物中心普通级昆明种小鼠) 无菌条件下取脑, 置于4℃D2Hank’s 液中, 体视显微镜下剔除脑膜, 脑组织放入盛有适量D2Hank’s 液的玻璃匀浆器中上下匀浆10 次。经孔径88 Lm (220 目) 的尼龙网过滤匀浆悬液, 洗涤、离心(1200 r×10 m in) 收集滤网上面的微血管段, 用011% I 型胶原酶于37℃水浴中消化30m in, 吸管吹打。离心(1200 r×10 m in) , 弃上清后加D2Hank’s 液再离心, 重复一次。收集沉淀, 用含15% 新生牛血清的DM EM 培养液(Hepes 20mmo löL , EDGF 10 Llöm l, 青霉素100 U öm l, 链霉素100 U öm l) 悬浮接种于多聚赖氨酸覆盖的培养瓶中, 37℃、5%CO 2 的培养箱(美国Fo rm a 公司) 中孵育, 4 h 后换全液, 以后每2 天换液一次, 并用刮除法去除非内皮细胞, 至细胞铺满瓶底。培养过程中,细胞标本用SP 试剂盒进行Ð 因子相关抗原(福州迈新公司) 的鉴定。离心包埋法制备电镜标本, HU 212A 透射电镜下观察、摄影。

1.2 传代培养　待细胞出现“铺路石”征象, 弃培养液, 用01125% 胰酶20102%EDTA 消化, 并在倒置相差显微镜下观察, 当发现细胞回缩、细胞间隙增大后, 立即加血清终止消化, 离心收集内皮细胞, 以1∶2比例稀释接种于培养瓶中, 以后每两天换液一次至细胞铺满瓶底。

1.3 生化指标　原代、传代培养每组各取8 例, 待 细胞铺满瓶底时, 吸取培养液用酶联免疫吸附试验测试TPA 活性(TPA 试剂盒购自上海医科大学分子遗传研究室)。

2.结　果

倒置相差显微镜下观察经匀浆、过滤分离出的脑微血管段, 可见其呈单枝或分枝状, 内皮细胞核清晰(图1)。经酶处理后的微血管段, 接种1 h 后细胞开始贴壁, 最初细胞形态呈单一的球形, 培养5～ 7天后, 细胞呈长梭形, 至第12 天, 细胞铺展开来, 形成致密的单层细胞, 呈“铺路石”征象(图2)。生长成片后的培养内皮细胞没有向多层生长的倾向, 也没有边缘的重叠。透射电镜下观察(图3, 4) , 可见细胞胞质内质网、高尔基复合体发达, 游离核糖体、线粒体及吞饮小泡丰富, 胞质中存在大量走向一致的微丝, 尤以周围部明显。双层核膜清晰可见, 未见W eibel2Palade 小体。相邻内皮细胞间有紧密连接。原代细胞进行Ð 因子相关抗原免疫组织化学检查,可见细胞浆被染成土黄色(图5) , 证实培养的细胞为血管内皮细胞。原代培养内皮细胞TPA 活性为(191440±11728) ×10- 2 IU öm l, 传代培养内皮细胞TPA 活性为(161450±01562) ×10- 2 IU öm l。