番红固绿染色原理，实验步骤以及需要注意什么？

一、番红固绿染色原理

番红固绿染色原理是一种组织学染色方法，常用于对组织切片中胶原纤维和肌纤维进行染色。该方法的原理是：组织切片首先经过甲醛等固定剂固定，然后使用番红（Ponceau S）染色，番红可染色蛋白质和胶原纤维，使它们变为粉红色。接下来再用酸性绿染色剂染色，酸性绿主要染色肌肉纤维，使它们呈绿色。经过两种染色后，胶原纤维和肌肉纤维就可以清晰地区分出来，呈现出不同的颜色，使组织结构更加明显。

二、实验步骤

1 脱蜡

1) 70 ℃烤片30 min；

2) 二甲苯（I）中脱蜡10 min；

3) 二甲苯（II）中脱蜡10 min；

4) 100%乙醇（I）中5 min洗去二甲苯；

5) 100%乙醇（II）中5 min洗去二甲苯；

2 水化

1) 95%乙醇中水化5 min；

2) 85%乙醇中水化5 min；

3) 75%乙醇中水化5 min；

4) 蒸馏水中水化待用；

3 染色

1) 番红染色1-2 h；

2) 流水稍洗；

3) 固绿染色1min 左右；

4 脱水

1) 无水乙醇脱水5 min；

2) 无水乙醇脱水5 min；

5 透明

1) 二甲苯（I）透明5 min；

2) 二甲苯（II）再次透明5 min；

6 封片

在石蜡切片的中央滴加一滴中性树胶，盖上盖玻片封固。

7镜检

显微镜下观察拍照。

三、番红固绿染色要注意什么番红固绿染色是一种较为简单的染色方法，但在进行染色过程中，还是有一些需要注意的事项：

固定时间要适当：组织切片在进行染色前需要用固定剂进行固定，固定时间过长或过短都会影响染色效果。固定时间过长会导致细胞变性、胶原纤维变硬、失去染色能力，而固定时间过短会导致细胞和组织结构失去完整性，影响染色效果。

染色剂的使用量要合适：番红和酸性绿的使用量要根据组织切片的大小适当调整，过多或过少都会影响染色效果。通常情况下，每次使用的染色剂量要比组织切片的体积多一些，以充分覆盖整个组织切片。

染色时间不能过长：番红固绿染色时间一般在10-20分钟之间，时间过长会导致颜色变深，影响观察效果。

染色后要彻底洗涤：染色后要用大量的蒸馏水和乙醇洗涤组织切片，去除多余染色剂，否则会影响观察效果。

染色后要及时封片：染色后的组织切片要尽快进行封片，以避免染色剂的挥发和蒸发，影响染色效果。