Tunel染色实验原理与步骤详解

TUNEL染色是检测细胞凋亡染色的常见方法，其原理是细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180~200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上荧光素、生物素标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜或化学显色方法检测细胞凋亡的情况。

Tunel检测细胞凋亡的详细操作方法如下：

1.常规方法制作石蜡切片，用二甲苯浸洗2次，每次5 min;

2.用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次，每次3 min;

3.PBS漂洗2次用ProteinaseK工作液(20ug/ml)处理组织15-30 min，在21-37°C(温度、时间、浓度均需摸索)或者加细胞通透液8 min;

4.加入PBS，室温反应5 min，PBS漂洗2次

5.制备TUNEL反应混合液，处理组用50 ulTdT、450 ul荧光素标计的dUTP液混匀，而阴性对照组仅加50 ul荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100 ulDNase1，15~25℃x10 min反应，后面步骤同处理组。

6,玻片干后，用滤纸小心吸去切片周围多余液体，加50 ulTUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50 ul荧光素标记的dUTP液），于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃，1 h。

7.加入到已预热37℃的洗涤与终止反应缓冲液，37℃保温30 min，PBS漂洗3次;

8,可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋广细胞(激发光波长为450~500 nm，检测波长头515~565 nm);

9.玻片干后加50 ulDIG-POD干标本上，加盖玻片或封口膜，在暗漏盒中反应37℃，30 min.

10.PBS漂洗3次；在组织外加50~100uIDAB底物，反应15~25C，10 min:

11.PBS漂洗3次；拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

12.加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞(共计200~500个细胞)并拍照。

可结合凋亡细胞形态特征来综合判断(未染色细胞变小、胞膜完整但出现发泡现象；晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化、核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体)