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细胞技术

Lentivirus的包装和感染

2025-03-01 细胞技术 加入收藏
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相关专题   1 转染前一天将293T细胞铺于10cm板,当细胞密度达到80%左右即可进行PEI转染。 2将下列DNA加入一个已装有480ul 1* HBS( PH 7.4)灭菌管混匀 三质粒 系统: 12ug vector 6ug VSVG 9ug PHR 四质粒系统: 12ug vector 6ug VSVG 6ug RSV-REV 6ug pMDL 3. 将10* PEI 剧烈振荡后加入到360ul 1* HBS( PH 7.4)灭菌管混匀 4. 将混匀的PEI加入到装有DNA的灭菌管中,用枪头吹吸15次混匀,室温30分钟 5.吸去待转染细胞的培养液换成5ml无血清DMEM培养,待DNA静置时间到达,将DNA混合液逐滴均匀加入到细胞培养 皿中,用手轻摇混匀平皿 6.6-8小时后,将无血清DMEM 移去,换成13ml 10%血清的正常DMEM于37培养包装病毒 7.在随后的三天,每天收集细胞上清于一个灭菌的50ml管中保存于4℃,随后更换新鲜培养液 注:对于pBoBi和pll3.7来说,决定其滴度的关键因素就是包装质粒时的转染效率 8. 收集的细胞上清液经过0.45um一次性滤器过滤,除去细胞碎片 9.将35ml过滤的上清加入到一个高速离心管中,离心管用培养液平衡并用封口膜封口 10. 4℃,70000g离心2小时后,用移液管小心移去上清,加入1ml培养液并用移液管小心吹吸大概20下至沉淀溶解 11. 收集到的病毒根据所需量,在终浓度6-10ng/ul polybrene 存在下加入到70%左右目的细胞的6孔板中 注:收集的病毒也可液氮速冻后至于-80℃保存,冻存的浓缩病毒应该没有滴度降低, 12. 6孔板于37℃2500rpm离心30分钟后,置于37℃培养 13. 24小时后观察细胞转染效率和细胞状态并换液 注:如果此时发现细胞大量死亡,可以考虑减少感染时间,或是降低polybrene浓度

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