细胞培养和转染

第三章 细胞培养和转染 1. 细胞培养(HEK293T) 1) 显微镜下观察细胞，细胞生长状态良好，去上清； 2) 加入预热的PBS 3ml, 温柔地清洗细胞,弃去PBS； 3) 用胰蛋白酶消化细胞，通常75cm2 培养瓶的贴壁细胞用3ml 胰蛋白酶于37oC 处理5min； 4) 待细胞脱落后，加入5ml DMEM 培养液(含10%FBS)以终止消化反应，并将 细胞悬液转移入15ml 或50ml 离心管中； 5) 1000rpm 离心5min，去除上清； 6) 加入10ml DMEM 培养液(含10%FBS)，重新悬浮细胞，使细胞充分打散； 7) 进行细胞计数,(4 个大方格细胞数的均值×104 个为每ml 所含细胞数)； 8) 根据细胞计数结果，将适当数量的细胞悬液转接入含有新鲜培养液的培养瓶 或皿中；(第二天做转染，A.Fugene6 法--细胞总量应达4-5×106 /10cm 培养 皿; B. 磷酸钙法: 细胞总量应达3×106 / 10cm 培养皿)； 9) 置于37 ℃ 5％CO2 的培养箱中培养 (注意培养箱应有足够的水分)。 注：以上所使用的胰蛋白酶、培养液等在使用前都置于37℃水浴中预热，以减 小对细胞的刺激。 2. 细胞转染 2.1 脂质体介导的贴壁细胞转染法 以下针对293T 细胞、10cm 培养皿 目前主要使用试剂盒为Roche 公司的FuGENETM6 Transfection Reagent 1) 转染前24 小时以4-5×106 /10cm 培养皿的细胞总量铺板，当细胞生长状态 第三章 细胞培养和转染 18 良好且贴壁细胞密度达到50~80%时即可进行转染； 2) 在1.5ml 离心管中加入需要共转的2 种质粒DNA 各5μg，混匀。 3) 将50μl FuGENE6 脂质体加入500μl DMEM(serum free)培养液(注意不要 将FuGENE6 脂质体沾到管壁)，加入前述DNA，轻轻混匀，RT 培养30 分 钟； 4) 将含有DNA 和脂质体的液体小心加入到培养皿中，分散均匀，置于37 ℃ 5 ％CO2 的培养箱中培养24－48 小时。 2.2 磷酸钙介导的贴壁细胞转染法 以下针对293T 细胞、10cm 培养皿(参照《分子克隆实验指南(第三