过氧化物酶TMB法

过氧化物酶TMB法 TMB法：原理同DAB法，但反应产物呈深蓝色沉淀。 1)孵育液配制 A液：亚硝基铁氰化钠(硝普钠) 100mg H20 92．5ml 0．2mol/L醋酸缓冲液(pH 3．3) 5ml B液：TMB 5mg 无水乙醇 2～4ml 临用前将A液和B液混合即为预孵育液。在每100ml预孵育液中加0．3％H202 1～ 5ml即为孵育液。 2)染色程序： ①组织固定于0．1mol/LPBS配制的3％戊二醛固定液中37℃ 30分钟； ②浸洗：用0．1mol/LPBS浸洗3次以上，每次15分钟或浸洗过夜，以除去内源性细胞色素C，抑制细胞色素氧化酶的夹杂反应； ③冰冻切片：厚5～15um； ④预孵育：切片人预孵育液中室温避光孵育20分钟，不断晃动切片； ⑤孵育：切片人孵育液中室温避光孵育10～20分钟，不断晃动切片； ⑥浸洗：将切片转移到0．2mol/L醋酸缓冲液(pH 3．3)中，0～4℃浸洗6次，每次30分钟； ⑦封片：甘油明胶封片。 3)结果：酶活性部位呈深蓝色沉淀。