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细胞技术

碱性磷酸酶偶氮―偶联法

2025-03-11 细胞技术 加入收藏
碱性磷酸酶偶氮―耦连法 人工合成的磷酸萘酚盐经碱性磷酸酶水解后释放出萘酚,后者立即与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素。 1)孵育液配制 萘酚AS(或萘酚AS-MX)

碱性磷酸酶偶氮―耦连法 人工合成的磷酸萘酚盐经碱性磷酸酶水解后释放出萘酚,后者立即与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素。 1)孵育液配制 萘酚AS(或萘酚AS-MX) 10―25rug N,N―二甲基甲酰胺液 0.5ml 0.2mol/LTris盐酸缓冲液(pH 8.2―9.2) 50ml 坚牢蓝B(或BB、RR,或坚牢红TR、坚牢蓝VRT) 50mg 混合、搅拌及过滤,必要时可使用氢氧化钠调整pH。 2)操作程序: ①新鲜组织冰冻切片: ②人孵育液,37C(或室温下)孵育5―60分钟; ③双蒸水洗3~5分钟; ④4%甲醛,室温下固定10~15分钟; ⑤蒸馏水洗3~5分钟; ⑥甘油明胶封固。 3)结果与评价: 采用不同的重氮盐。酶的活性显色也不同,用坚牢蓝B(或BB、RR)酶活性呈蓝紫色,用坚牢红TR(或坚牢紫B)酶活性呈红色。萘酚法有三个优点: ①反应产物溶解度小。局部比较明显; ②萘酚化合物能较快地被水解,可缩短孵育时间; ③反应产物立即可见,并显示出颜色。 4)对照实验:方法与钙―钴法相同。

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