细胞培养经验

细胞培养经验谈

细胞生存所需营养和添加物

l  氨基酸   合成蛋白质。

l  糖    葡萄糖为主，提供能量代谢。

l  激素    很多激素具有促细胞生长作用

l  谷氨酰胺    促进氨基酸进入细胞膜，是核酸的成分。（注意：备用培基放置15天后需要补充谷氨酰胺）

l  抗菌素    青霉素100单位/ 毫升、链霉素100微克/毫升，制霉菌素25单位/毫升。

l   微量元素

l  生物刺激源   有些细胞须特殊刺激因子，例ECGF、NGF、TGF、FGF、HGF、EGF等。

l  生长基质成分    胶原、纤维连接蛋白、明胶、多聚赖氨酸。

l  细胞生长的密度依赖性   单个细胞不易生长，要加同种动物巨噬细胞补充密度，一般用腹腔巨噬细胞，105/ml。

血清：

l  1.促细胞生长因子，维生素,  激素及营养物质，其中的蛋白可解除脂肪酸、重金属离子、蛋白酶对细胞的毒性作用。

l  2.促进细胞贴壁。

l  3.小牛血清和胎牛血清应用最多，有的血清对细胞有毒性，要筛选。胎盘血清较成人血清好（胎盘血清含丰富的生长激素）

l  4.AB型血清无凝集素，可广泛使用自身血清在自身细胞培养时应用较好。

l  5.马血清、鸡血清在某些细胞培养时应用。

l  应用：须无菌，不溶血，分装保存-20℃，可用数年，但不能反复冻融。应用前灭活，56℃，30min。毒性和支原体检查，一般浓度5—20%

无菌操作

l  无菌室每周用过氧乙酸加紫外线消毒1一2次，

l  实验前，将实验器材放入超净台，同时启动风机紫外线照射30分钟后消毒完毕，使净化台内空气和台面构成无菌环境。

l  手指不能触及器材使用端，若碰到要更换。减少手与器材的接触面积，

l  一切操作都要在火焰周围进行，避免手从瓶口或其他器材上方经过，瓶口要经火焰消毒。

l  培养用液要专管专用，勤换吸管，防止扩大污染和交叉污染。

l  操作者动作要准确敏捷，尽量避免空气流动。

组织分离方法：

l   离心法：羊水，胸腹水、骨髓等，用细胞分离液进行密度梯度离心分离细胞。

l  组织切割法：无菌剥离脂肪及结缔组织，用含抗菌素的培养液洗涤去血液，用眼科剪剪成1mm3小块。

l   消化分离法：

l   a 胰蛋白酶消化法: 用不含Ca++、Mg++的PBS配成0.1—0.25%的浓度，PH7.6，多用于贴附细胞传代。在做原代组织培养时可用胰酶松散组织，但不得超过30分钟。蛋白可吸附此酶，因此被消化的细胞要先洗去培养液。

l   b. 胶原酶消化法：主要用于纤维间质多的组织、软骨组织的消化，不受Ca++，Mg++影响，浓度0.1－0.3%，37℃1—24小时。

l  c. EDTA消化应不含Ca++、Mg++，EDTA可与Ca++、Mg++结合使细胞松散。浓度0.02％。

细胞消化传代

l  消化液   0.25％胰蛋白酶或0.1％胰酶含0.02%EDTA。

l  方法   1.悬浮细胞采用离心法传代或直接传代法。2.贴壁细胞传代用酶消化法：即平衡盐溶液洗涤细胞二次，加消化液，以刚好覆盖细胞为宜。放入370C培养箱片刻，不要震摇，在倒置显微镜下观察细胞消化变化，大部分细胞回缩变圆，间隙增大，用完全培基终止消化。用湾头吸管有序的吹下瓶壁细胞。将细胞悬液混匀使成单个细胞，分瓶加培养液继续培养。

细胞冻存与复苏

 为了长期保存细胞、须冻存，可存数年。

l  冻存液： 培养液7份，血清2份，二甲基亚砜（DMSO）1份， 。

l  冻存方法： 冻存细胞的前一天换培养液，贴壁细胞经常规消化，洗涤，调整细胞浓度约106/ml, 用弹指法将细胞打散，逐滴加入冷的冻存液，迅速加入冻存管中，1.5ml/管。做好标记，-20℃2小时，-70℃过夜，入液氮冻存。

l  复苏方法:  备40℃水一杯，从液氮罐中取出所需细胞，迅速放入温水中解冻，待冰全部融化后，加入冷完全培养液中，离心洗涤两次，转入培养瓶培养。2-3天换液、传代。

细胞运输

l  1.长距离运输   选择生长良好的单层细胞加培养液至瓶颈，保留微量空气，拧紧瓶盖，用胶带封好，包裹棉花，放在贴身口袋即可。到达目的地，吸出多于培养液（此液可继续使用），按常规培养。

l  2.短距离运输   （几小时）仅留少量培养液，防止细胞干燥，将细胞面朝上带回。

培养中细胞生长情况的识别

l   细胞生长   

         贴壁细胞增殖向周围扩张，互相融合连成片，可见细胞隆起饱满。 悬浮细胞呈圆形，具有折光性，大小不一，细胞壁光滑，透明无颗粒，细胞增殖旺盛时培养液易变酸。应及时更换培养液。

l   细胞死亡

        表现：贴壁细胞开始回缩变圆或成细丝状，细胞间隙增大，胞壁增厚，胞内颗粒增加，粗糙，脱落，崩溃解体。悬浮细胞无光泽，胞内颗粒呈棕黑色，最后液化消失。

        原因：污染，PH不适，谷氨酰胺过期，血清质量不佳，培养液过期和未及时换培养液，胶塞烧燃产生毒物，支原体污染，培养器皿不干净，水不纯等复杂原因。

商用细胞库

美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,  ATCC) 。

地址： American Type Culture Collection， Rockville, maryland  20852,USA。

 ATCC网址：http//www.atcc.org/

中国典型培养物保藏中心( China Center Type Culture Collection， CCTCC)

地址：武汉大学生命科学院中国典型培养物保藏中心(邮政编码430072)联系电话：027－87682378

中科院细胞库  网址http//www.cell.ac.cn/cellbank/。

地址：上海岳阳路320号中国科学院上海细胞所细胞库

（邮政编码：200031）。联系电话：021－64315030－2052

细胞培养用品的消毒和处理

l  玻璃用品清洗：（新玻璃用品用5%盐酸浸泡）清水冲洗→洗涤剂刷→清水→干→清洁液（重铬酸钾190克，加水240ml溶解，加入H2SO43000ml）→清水→蒸馏水

l  塑料用品回收性清洗：

      清水冲洗→洗涤剂刷→清水→干→清洁液（重铬酸钾190克，加水240ml溶解，加入H2SO43000ml）4小时→清水→75%酒精（分析纯）浸泡过夜→蒸馏水洗→37℃烘干→紫外线（2小时）或环氧已烷消毒。  个别塑料（硬质），可10磅10分钟高压(放在保护性容器内)。

l  滤器：生物制剂均应过滤除菌。一次性滤器不能回收，有大小不等规格。

l  橡皮塞： 肥皂煮→清水洗，不要用腐蚀性液体浸泡，不宜高压，微波煮5-10min除菌。

 空气消毒：紫外线，乳酸蒸气。