大鼠脑皮质微血管内皮细胞的培养

【摘　要】目的：培养脑皮质微血管内皮细胞。方法：取1～5d Wistar乳鼠脑皮质,经不同孔径的筛网过滤后，用胶原酶振荡消化获得的微血管内皮细胞进行培养，用Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定。结果：培养的细胞呈单层贴壁生长，7～9d呈典型的铺路卵石样征象。结论：建立了一种简便易行的培养脑皮质微血管内皮细胞的方法。

【关键词】 细胞培养；微血管内皮细胞；Wistar大鼠

脑微血管内皮细胞是构成血脑屏障的主要成分，具有特殊的形态结构和机能，在许多病理状态下起重要作用[1]。建立脑微血管内皮细胞体外培养，可获得大量比较单纯的内皮细胞，为研究血脑屏障和脑血管疾病以及新药筛选提供实验模型。本文报告大鼠脑皮质微血管内皮细胞培养的一种方法。

1.材料与方法

1.1 鼠脑皮质微血管内皮细胞培养

1.1.1 鼠脑皮质微血管内皮细胞的分离　　取10～12只1～5d的Wistar大鼠（重庆医科大学实验动物中心提供），雌雄兼用，于超净工作台上操作者左手拇食二指持乳鼠颈部稍下处，常规消毒头皮后，右手持眼科剪沿正中线剪开头皮与颅骨，用眼科弯镊取出鼠脑。取出的脑立即放入盛有冰冷Hank's液的平皿中。去除大血管、软脑膜、脑干、小脑和大脑髓质。将收集到的大脑皮质，转入另一先放有170μm不锈钢筛网的冰冷Hank's液的平皿中，用玻璃吸管反复吹打呈脑匀浆，弃滤液，再用Hank's液反复冲洗网上的血管，将收集的血管段液再经孔径75μm尼龙网过滤，500转离心3min，弃上清，收集沉淀的血管段。

1.1.2　原代微血管内皮细胞培养　将　微血管段移入0.1‰的Ⅶ胶原酶中37℃振荡消化20min，800r/min离心3min，弃上清，沉淀物加入含15%胎牛血清的M199（完全培养液）制成细胞悬液，接种于35ml 塑料培养瓶(Nunclon)中（瓶底朝上），置37℃，5%CO2培养箱孵育，2h后翻转培养瓶（瓶底朝下），1d后换全液，以剔除混杂的非内皮细胞，以后每3d换完全培养液1次进行细胞原代培养。

1.1.3　细胞传代培养　细胞原代培养7～9d后，细胞呈单层密集生长近亚融合时进行传代繁殖，以0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化细胞，见细胞大部分脱落时加入完全培养液终止消化,轻轻吹打,制成细胞悬液,按实验需要传代,传代时接种密度为3×104 /ml。

1.2　特性鉴定

1.2.1 　形态学　用Olympus倒置显微镜观察内皮细胞的形态及生长规律。

1.2.2　用MTT法测内皮细胞的生长率　　传代培养至第3代，接种于24孔培养板中，接种密度为3×104/ml，在1～11d 内，每天收集3孔的细胞进行MTT法测细胞的活力。即细胞培养至所选时间，弃上清，每孔加入400μl M199，40μl MTT继续培养4h后，离心2000转，5min，弃上清，每孔加入400μl二甲基亚砜溶解紫色结晶，再转入96孔板，于自动酶标仪上测定OD570 值，吸光度值的大小反映内皮细胞成活数量及活性。

1.2.3 　免疫组化　将长有细胞的盖玻片取出，用浓度为0.1 mmol/L PBS漂洗后，4℃丙酮固定10min，滴加Ⅷ因子相关抗原的抗体(博士德，即用型)，再按通用型SP kit (北京中山)说明进行操作，DAB显色，封片后镜下观察和照相。

2.结　果

2.1 细胞形态学观察

倒置显微镜观察分离的微血管段形态各异，长短不等，呈单枝或多枝状。经胶原酶消化后，微血管管壁不清，壁上内皮细胞清晰可见。2h后翻转培养瓶，目的是去除首先贴壁的长梭形成纤维细胞。混悬液内还有未分离干净的神经组织碎片和红细胞，1d后换全液即可清除，换液后可见大部分微血管片段已贴壁，边缘长出单个内皮细胞，呈三角形或长梭形，排列不规则，核淡，胞膜明显，2～3d可见细胞分裂增殖形成散在细胞群落，7～9d融合成片状，细胞紧密排列，互不重叠，呈典型的铺路卵石样结构(见图1)。传代细胞初种时为明亮的园球形，悬浮于培养液中，4h后大部分细胞贴壁，呈扁平状，24h后细胞胞体变大，随培养时间延长，细胞多呈三角形或长梭形，7d后细胞增殖成单层片状。传至第4代时细胞轮廓欠清。测定第三代内皮细胞的生长率表明内皮细胞的生长高峰在7～9d 以后不再增殖，出现生长接触抑制现象。

2.2 免疫组化

原代、第三代内皮细胞进行ⅧF：Ag免疫组化检查，95%以上细胞的胞浆和核膜周围被染成棕褐色，证实培养的内皮细胞为血管内皮细胞。

3.讨　论

血管内皮遍布全身，位于整个循环系统的内表面，它不仅是血管的被动衬里，而且是肌体最大的内分泌腺[2]。由于它所处的特殊位置，可通过不同的机制和生化信息，来释放血管活性物质、细胞因子和生长因子，以调节免疫反应、血液流动性、凝血过程、血管床张力及通透性，参与正常和新生组织的血管形成。脑微血管内皮细胞是位于毛细血管微循环的一种特殊细胞，具有极其重要的功能。它是构成血脑屏障的主要成分，同时与脑水肿、脑血管疾病的发生发展、脑肿瘤的浸润和扩散，尤其是脑肿瘤的血管形成等病理过程紧密相关。我们对鼠脑皮质微血管内皮细胞培养的偿试，为体外研究各种颅脑疾病提供一种崭新的实验工具。由于不同来源的血管内皮细胞之间存在较大的差异性，人们常根据不同的研究目的选取不同的血管内皮细胞进行培养。

国外对脑微血管内皮细胞的分离培养始于70年代末，难点主要在于脑微血管分离步骤繁杂、内皮细胞难以纯化，建立与维持微血管内皮细胞很难，且有些方法不适合于国内普通实验室，如需要高速冷冻离心机和价格昂贵的内皮细胞生长因子等 [3]，故国内关于脑微血管内皮细胞培养方法的报道较少。我们根据本校条件，探讨了培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法，成功进行了Wistar 乳鼠大脑皮质微血管内皮细胞的体外培养。

根据我们的体会，培养时应注意以下几点：

(1)仔细剥离软脑膜，去除脑干、大血管、小脑和大脑髓质后，吹打成匀浆的脑组织经过 170μm和75μm两种孔径滤网过滤，这样既可去除较大组织块和大血管，又可达到收集微血管段的目的，因据Brendel等[4]研究发现鼠脑微血管的直径在6～80μm之间，分离脑微血管多选直径80μm左右的滤网筛选。

(2)胶原酶充分消化。我们用0.1‰的Ⅶ胶原酶在37℃恒温摇床振荡消化20min即可。酶充分消化有助于内皮细胞的迁移、去除周皮细胞。消化时间的长短因胶原酶的类型与不同的浓度而有所不同。

(3)原代培养时需收集到足够量的微血管，否则培养难以成功。

(4) 原代培养2h后，翻转培养瓶以去除先贴壁的成纤维细胞，24h后换液一次以去除未贴壁的杂质，净化培养环境。开始培养的2～5d，在倒置显微镜下用机械方法(细胞刮刀)刮去可疑的细胞或细胞群落。(5)传代培养时，只收集最先脱落的细胞进行培养，这是因为内皮细胞具有贴壁早，而在酶消化时易脱落的特性[5]。(6)培养内皮细胞最好选用含15%胎牛血清的M199培养液来培养，这样有利于内皮细胞的生长、逐渐淘汰混杂的神经元和胶质细胞。

参　考　文　献　

[1] Chi OZ, Wei NM, Sinha AK, et al. Effects of inhibition of nitric oxide synthase on blood-brain barrier transport in focal cerebral ischemia[J]. Pharmacology,1994;48:367-373.

[2] Inagami T, Naruse M, Richard H. Endothelium as an endocrine organ[J]. Annu Rev Physiol,1995;57:171-189.

[3] Gordon EL, Danielsson PE, Hguyen TS, et al. A comparision of primary cultures of rat cerebral microvascular endothelial cells to rat aortic endothelial cells[J]. In Vitro Cell Dev Biol,1991;27A:312-326.

[4] Brendel K, Meezan E, Carlson EC. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex[J]. Science, 1974;185:953-955.

[5] Browman PD, Betz AL, Diane AR,et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain[J]. In Vitro,1981;17(4):253-262.