细胞株的培养、冻存和复苏

1、细胞株的培养和传代：

培养：

用于检测细胞因子的细胞株通常培养于含10％小牛血清和抗生素的培养液中，培养细胞因子依赖细胞株还有加入适量细胞因子。在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养，3～4天传代一次。

悬浮生长细胞的传代：

直接直接吸去或离心后吸去培养上清液，用新鲜培养液悬浮细胞，1：3或1：5稀释细胞后，分瓶继续培养。

帖壁生长细胞的传代：

吸去培养液，用PBS洗涤细胞一次，加入消化液，在37℃中消化约3～10分钟，待细胞开始脱落时，倒去消化液，加入新鲜培养液，悬浮和吹打分散细胞。也可以待细胞完全消化脱落，500×g离心5分钟，去除消化液，用新鲜培养液悬浮细胞。1：3或1：5稀释细胞后，分瓶继续培养。

2、细胞株的冻存：

（1）取培养2～3天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106～2×107/ml。

（2）在1ml细胞冻存管中加入0.5ml细胞悬液，0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亚砜（或甘油），混匀后密封。置4℃ 1小时，－20℃ 2小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。

3、细胞株的复苏：

复苏时，从液氮中取出冻存管，立即置37℃水浴中融化细胞。将细胞直接加入10ml含15％小牛血清的RPMI-1640培养液中，置37℃ 5％CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养。悬浮细胞待细胞全部沉降后小心吸去上清液，更换新鲜的上述培养液，继续培养；帖壁细胞则培养2～3实验。