大规模动物细胞培养的问题及对策

动物细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求，动物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求，迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前，世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。

细胞培养环境

细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一。氨的积聚使细胞内UDP氨基己糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影响细胞的生长及蛋白的糖基化过程。氨抑制Gln代谢途径，使Asp和Glu消耗增加。细胞消耗Asp增加，可能是细胞线粒体膜上苹果酸－天冬氨酸泵转运NADH加快，使细胞维持糖酵解途径的需要。Asp消耗增加可能会从Gln代谢多经天冬氨酸转氨酶途径而不是丙氨酸转氨酶或谷氨酸脱氢酶途径得以补偿。

氨来源于两方面：一是直接来源于培养基，一是细胞代谢所产生。但两者都涉及谷氨酰胺，因此需要防止培养基中Gln自然分解，限制Gln用量，并尽量去除培养基中的氨。

乳酸是细胞糖代谢的产物。高浓度乳酸会抑制乳酸脱氢酶(LDH），从而减少乳酸产生。LDH受抑制后阻止了NADH向NAD的再生及其偶联的丙酮酸/乳酸转换，从而导致NADH增加。NADH增加，部分抑制糖酵解。乳酸抑制糖酵解也导致低浓度丙酮酸，从而导致Gln消耗减少。由于糖酵解和Gln的分解速度降低，能量产生减少，更多的能量用于维持离子浓度梯度，因此高乳酸浓度必将抑制细胞生长。

氨和乳酸对细胞的毒性作用已在多种不同的细胞系有大量报道，不同细胞系对于这两种代谢产物的耐受性差别很大，原因可能是不同细胞系葡萄糖和谷氨酰胺代谢过程中关键酶的敏感性不同，或者在不良生长环境下，细胞转换代谢途径，特别是氨基酸代谢的改变。由于Gln和葡萄糖代谢的相互影响，因此降低培养基中葡萄糖浓度以减少乳酸产生的同时，必须平衡葡萄糖和Gln的比例。这些代谢改变机理的研究将有利于设计适当的控制方案。

随着细胞培养规模和培养密度的增大，由于二氧化碳的产生速率比通过换气从培养基中去除二氧化碳快因而导致CO2积聚，从而对细胞产生毒性作用或者改变细胞代谢水平。CHO细胞大规模培养的生物反应器中，最适CO2水平为4%～10％。当达到14％时便会阻碍细胞生长。在一定的pH条件下，CO2分压升高会使培养基渗透压升高。常规/高渗透压条件下，高CO2分压使重组CHO细胞系的生长和组织型纤溶酶原激活剂(tPA)产率均受到抑制。

当CO2分压升高时，tPA糖链中包含N-羟乙酰神经氨酸的唾液酸比例稍下降，但tPA的总唾液酸含量、其他单糖含量、tPA的I型II型相对含量、表面电荷分布和高－甘露糖单糖比例等影响产品质量及一致性的因素在高CO2条件下也没有改变。这表明CHO细胞生产tPA具有很强糖基化能力。尽管如此，控制通气参数，平衡氧的输送及CO2的去除，防止生物反应器运转中CO2积聚仍是明智选择。

甲基乙二醛(MG)主要是丙糖磷酸去除磷酸基后的代谢产物，也是脂类、氨基酸代谢的产物，对于细胞有潜在的损伤作用。MG能改变氨基酸、蛋白质和核酸的氨基和巯基。细胞内MG的水平由乙二醛缩酶和还原酶两种酶的活性来平衡，代谢途径是糖酵解途径。

葡萄糖浓度很高(100mM)时，细胞内MG几乎是正常培养条件下的两倍。增加培养基中谷氨酰胺浓度也会引起MG中度增加。用腐败假单胞菌乙二醛缩酶基因转染的CHO细胞中乙二醛缩酶活性增长至三倍多，MG浓度比野生型CHO低。

然而，MG浓度降低的细胞与在典型生物反应器培养条件下的细胞的生长活力有何不同尚未确定。通过批次培养中限制葡萄糖用量来降低葡萄糖消耗，由此来确定降低糖酵解代谢是否导致细胞内MG浓度降低，从而最终确定MG浓度降低是否提高培养活力或影响产品特性的研究具有重要意义。另外，培养基中加入胎牛血清可降低MG浓度。

不管用NaCl、KCl还是蔗糖升高渗透压，均可增加批次培养中抗体浓度。细胞系间产率增加幅度不一，对骨髓瘤细胞影响较小。高渗透压不仅影响细胞批次培养中抗体或tPA产量，而且影响细胞生长速度、对数生长期的长短、细胞死亡的速度。由于细胞生长环境不断变化，有关渗透压影响的量化进展不大。然而，在大约400mOsm的范围内，细胞虽然生长减慢，但特定抗体产生增多，细胞浓度增大导致最终高产品浓度。

另外，在培养基中加入诸如甘氨酸甜菜碱、三甲基甘氨酸或脯氨酸等渗透压保护剂在一定程度上减轻了高渗透压对细胞的生长抑制作用，但不影响细胞表达目的蛋白质的水平，同时可使细胞较长时间的维持高水平表达。

多孔微载体的研制替代了容易使细胞受机械搅拌与喷气损伤的常规载体。为创造更大优势，多孔微载体内部保护空间必须保证细胞能够进入生长。对于有些细胞株尽管能贴在微载体内，但“移动性”很差，因此需要发明一种更好的培养方式，提高微孔的开放性或者改善其表面特性，从而提高细胞贴壁率同时增加细胞移动性。