从小鼠脾脏分离小鼠天然杀伤细胞

基本方案：

由于所用Mab只能检测C57BL背景小鼠体内的NK1.1CD3- NK细胞，故本方案适用于C57BL/6或者C57BL/10（以及H2b 、d、q 同系小鼠）小鼠脾脏细胞。

清楚杂细胞所用的单克隆抗体的活性对本方案至关重要。单克隆抗体可以买到，并且其杂交瘤可以从ATCC得到，因此建议检测单克隆抗体的活性以保证实验成功。最佳补体和细胞浓度也需要通过实验确定。

实验材料：

1. C57BL/6或者C57BL/10小鼠

2. Tris/NH4Cl裂解缓冲液

3. HBSS/3%（V/V）FBS

4. 10×单克隆抗体储存液

5. GK1.5（ATCC号TIB207）、53-6.72（TIB105）、M5/114.15.2（TIB120）、J11d.2（TIB183；PharMingen）

6. 单克隆抗体MAR18.5（TIB216；PharMingen）浓度1mg/ml

7. 含酚红的HBSS（Life Technologies）/10%（V/V）FBS

8. 低Tox-M兔补体，无菌复溶

9. 淋巴细胞M密度梯度分离液（Accurate Chemical and Scientific），室温

10. RPMI-10完全培养基

11. FITC标记的抗CD3抗体和PE标记的PK136抗体（PharMingen）

12. 15ml和50ml带盖聚丙烯锥底离心管

13. Beckman CS-6R离心机（或同类离心机）

14. 血清学吸管

实验方法：

1. 处死小鼠，无菌取脾脏。

2. 制备脾脏细胞悬液，置于50ml离心管中，避免将纤维性杂质移入离心管。200g离心5min以洗涤细胞。采用“去除脾脏细胞悬液中的红细胞”的方法裂解红细胞，或使用Tris/NH4Cl裂解缓冲液。每个脾脏的细胞用1ml HBSS/3%（V/V）FBS混悬。

3. 用台盼蓝拒染法计数活细胞。用HBSS/3% FBS混悬细胞至5×107 个细胞/ml。置于冰上保存。

4. 制备下述单克隆抗体的10×混合溶液（10×每种抗体的饱和浓度）：

GK1.5（抗CD4）

35-6.72（抗CD8）

M5/114.15.2（抗I-A和I-Ed,k ）

J11d.2（抗CD24）

5. 每0.9ml细胞悬液加入0.1ml单克隆抗体混合液，4℃孵育30min。

6. 用冰的HBSS/3% FBS洗细胞2遍，4℃，200g离心5min，弃上清。用10ml冰的HBSS/3% FBS混悬细胞再洗一遍。将细胞用HBSS/10% FBS混悬至浓度5×107 个细胞/ml。

7. 加入10mg/ml抗大鼠κ（MAR18.5；1mg/ml储存液）和低Tox-M兔补体至细胞悬液使其达到最佳终浓度（通常1：6，但需要根据经验确定）。37℃孵育45min，每15min振摇一次。

8. 用HBSS/10% FBS洗一遍（步骤6）。

9. 用5ml HBSS/10% FBS混悬细胞。取少量细胞悬液采用台盼蓝拒染法计数活细胞，以确定补体裂解效果。

10. 将5ml室温的淋巴细胞M密度梯度分离液加入到一个15ml离心管中。将5ml细胞悬液轻轻加在分离液上。室温，200g离心20min，使离心速度缓慢下降。

11. 用吸管从界面小心吸取液体，放在另一个15ml离心管中。必要时可将界面放在白色背景前以便看清。用RPMI-10完全培养基洗2遍（方法同步骤6）。台盼蓝染色计数活细胞，备用。

12. 为检验细胞纯度，可加入终浓度为10mg/ml的抗CD3-FITC和PK136-PE（抗NK1.1）抗体，进行流式分析。

附录：

HBSS/10%（V/V）FBS和HBSS/3%（V/V）FBS：56℃ 45min热灭活FBS，过滤。取HBSS，加入不同量的FBS，分别配置含10%和3%（V/V）FBS的HBSS溶液。在10%FBS的HBSS溶液中加入酚红，而3%FBS的溶液不加酚红，以示区分。4℃可保存6个月。

大鼠补体，低Tox-M，无菌复溶：将冻干的低Tox-M大鼠补体（Accurate Chemical and Scientific）用无菌的HPLC级的纯水溶解，临用前配置。如需要，可以用0.45mm滤膜过滤除菌。滴定法测定每批次产品的细胞毒活性。记住始终置于冰上操作。冻存时迅速置入-70℃冰箱中，于-70℃可保存6个月。

Tris/NH4Cl裂解缓冲液：90ml 0.16mol/L（8.3g/L）NH4Cl；10ml 0.17mol/L Tris·Cl，pH7.65；用HCl调pH至7.2；过滤除菌；室温可保存3个月