大鼠脑微血管内皮细胞的分离与原代培养

脑微血管内皮细胞是构成血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的重要成分，与外周血管内皮细胞不同，它具有高跨内皮阻抗（transendothelial electrical resistance，TER）、细胞间紧密连接、极少的胞饮小泡、缺乏窗孔结构以及含有选择性双向跨细胞膜转运系统等独有的特征，从而使血脑屏障形成一个限制大多数极性分子和蛋白质运动的选择性低渗透性的屏障[1]。由于体外培养的脑微血管内皮细胞保持了较多的其体内固有的特点[1]，因此目前脑微血管内皮细胞体外培养模型已被广泛应用于血脑屏障的研究、脑血管疾病的病理生理及分子生物学研究、新药筛选、脑微血管内皮细胞生理生化及药理学研究等领域。而大多数体内实验采用大鼠为动物模型，而且大鼠具有较多的细胞生物学研究所需的抗体可用，因此进行大鼠脑微血管内皮细胞的培养具有重要的意义。自从Panula等[2]首次成功培养大鼠脑微血管内皮细胞以来，国内外有关大鼠脑微血管内皮细胞的分离和培养方法已有较多的报道，我们发现国内的方法多以组织匀浆、两次尼龙网过滤分离脑微血管段为主[3,4]，也有采用酶消化、梯度离心及尼龙网过滤的[5]，但细胞得率均较低，而近些年来国外大多数方法采用以大脑皮质为材料、酶消化及梯度离心分离脑微血管段并进行原代培养[6~9,11,12]。由于原代培养中无法避免地混杂成纤维细胞、周细胞、平滑肌细胞、星型胶质细胞等其他细胞的生长，而且工作量大、过程繁琐且费用高[1]，进行较纯的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养一直是国内外的一个难点。

本人参照文献[6]、[7]、[8]的方法，成功地摸索出大鼠脑微血管内皮细胞分离和原代培养的方法，并获得纯度较高的脑微血管内皮细胞。

1.材料与方法

1.1 实验动物

每次实验采用10只2-3周龄SD大鼠，雌雄均可，体重40~60 g。

1.2 试剂

纤连蛋白（fibronectin），Ⅳ型胶原，鼠尾胶，葡聚糖（dextran，分子量100~200kDa），DNA酶Ⅰ（DNaseⅠ）购自Sigma公司；D-Hanks液，PBS，10×PBS按配方自制；Ⅱ型胶原酶购自Worthington公司；明胶，牛血清白蛋白（BSA），HEPES购自Amresco公司；Percoll购自Amersham Biosciences；DMEM（高糖）购自Gibco BRL公司；肝素钠，NaHCO3购自中国医药集团上海化学试剂公司；青、链霉素购自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清（FBS）购自PAA Laboratories；碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），胶原酶/分散酶（collagenase/dispase）购自Roche公司。

1.3 重要仪器

低温离心机（1 Centrifuge 5810 R，购自Eppendorf；2 himac CR 22F，购自Hitachi）

1.4 试剂配制

1mg/ml鼠尾胶（用0.2%乙酸配制），1%明胶（用D-Hanks液配制），1%Ⅱ型胶原酶（用DMEM配制，用时稀释成0.1%的浓度），1%胶原酶/分散酶（用DMEM配制，用时稀释成0.1%），15%葡聚糖（用PBS配制），20%BSA（用DMEM配制，调pH值至7.4后用0.45 um滤膜过滤除菌，较难过滤！），DNase Ⅰ（用冷PBS配制成2 U/ul），以上试剂经0.22 m滤膜过滤除菌后分装保存于-20 ℃；50%Percoll(配12 ml,需6 ml Percoll原液, 0.67 ml 10×PBS, 0.4 ml FBS，4.93 ml PBS)；DMEM培养液（含4000 mg/L D-葡萄糖，4 mmol/L L-谷氨酰胺，添加3.7 g/L NaHCO3，20 mmol/L HEPES，肝素钠 100 mg/L，青霉素 100 U/ml，链霉素 100 ug/ml），pH值调至7.4，过滤除菌后分装保存于4 ℃，用时加入20%FBS，1 ng/ml bFGF。

1.5 培养皿处理

涂布3种不同的基质：培养前一天加入1 ml 1%明胶于35mm塑料培养皿，置于37 ℃培养箱过夜，接种前用D-Hanks液漂洗2次；接种前4 h，加入鼠尾胶6~10 ug/cm2，在密闭的器皿里用氨气熏5~10 min后，置于室温1~2 h晾干后，用D-Hanks液漂洗2次；50ul 0.1%纤连蛋白、50ul 1 mg/ml Ⅳ型胶原和400ul双蒸水混合后，加入到每个培养皿中涂布均匀后吸出，可涂布10个培养皿，置于37 ℃培养箱1~2 h晾干后，用D-Hanks液漂洗2次。