正常人肺微血管内皮细胞培养

实验材料：

1. 手术切除的正常肺组织

2. 胰蛋白酶/EDTA液：0.05%胰蛋白酶，0.5mmol/L EDTA

3. 6孔培养板：用多聚赖氨酸包被

4. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS（pH=7.4），添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素和200000U/L庆大霉素，pH7.4

5. 手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪，眼科镊

6. 离心管（15ml、50ml）

实验方法：

1. 将肺组织至于无菌的培养皿中用含双抗的1×PBS（pH=7.4）清洗若干次至无明显血细胞；

2. 剪取肺组织边缘微血管丰富的组织，用含双抗的1×PBS（pH=7.4）清洗两次；

3. 将剪取的肺边缘组织剪成2-3mm3 大小，加入含双抗的1×PBS（pH=7.4）清洗；

4. 用进行过灭菌处理的玻璃滴管将剪碎的组织块和清洗用的1×PBS（pH=7.4）一起转入15ml离心管中；

5. 250rpm/min离心2 min，小心倾去液体，再加入适量的含双抗的1×PBS（pH=7.4），用玻璃滴管吹吸液体以清洗组织块；

6. 继续250rpm/min离心2 min，小心倾去液体，重复上述步骤若干次，直至离心后的液体中观察不到明显的红色；

7. 将清洗好的组织块重新转至无菌的培养皿中，用无菌的200 ml的吸头将组织块贴于25cm2 培养瓶中；

8. 加入2ml培养基，将培养瓶倒置放于37℃、5%CO2 的培养箱中2-3h之后正置培养瓶继续培养；

9. 培养若干天后，可观察到组织块周围陆续有细胞爬出，继续培养几天，直至组织块周围的细胞达到较高密度（培养其间两天换液一次，换液操作时动作一定要轻柔，以防组织块被摇下）；

10. 当组织块附近的细胞生长到较高密度后，将贴壁的组织块吹下，换新的培养基继续培养24；

11. 24h后，用0.25%的Trypsin-EDTA消化细胞，FBS中止消化，将消化后的细胞悬液转入15ml离心管，1000rpm/min离心5min，之后倾去废液，用培养基重悬细胞，转入原来的培养瓶中，继续在37℃、5%CO2 的培养箱中培养。