正常人角膜上皮细胞培养

实验材料：

1. 正常人角膜移植供体角膜

2. 胰蛋白酶/EDTA液：0.05%胰蛋白酶，0.5mmol/L EDTA

3. KGM：无血清角质形成细胞培养液，添加0.15mmol/L 钙、0.1ng/ml 人上皮生长因子、5mg/ml 胰岛素、0.5mg/ml 氢化可的松和30mg/ml 牛垂体提取物；MEM；PBSA；胎牛血清

4. FNC：10mg/ml 纤连蛋白、35ug/ml 胶原蛋白和100mg/ml BSA（bovine serum albumin）。BSA作为稳定剂

5. 6孔培养板：用鼠尾Ⅰ型胶原蛋白涂培养板底壁

6. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素和200000U/L庆大霉素，pH7.4

7. 手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪，眼科镊

8. 离心管（15ml、50ml）

实验方法：

1. 将供体角膜放于消毒过的容器上，上皮面朝上，用手术刀切成12个三角形组织片。应一刀切下，避免锯割。如此仔细处理角膜可减少对胶原基质的破坏和成纤维细胞的脱落。

2. 将角膜组织片的上皮面朝向下，放入用鼠尾Ⅰ型胶原蛋白预处理的6孔培养板，每孔放4个组织块。

3. 用镊子轻压组织片，以便使组织块与培养皿表面充分接触。将组织片放置20min，使其变干。

4. 将一滴KGM轻轻滴于组织片上，在37℃和5%CO2 条件下孵育过夜。尽管从眼库得到的供体角膜是用抗菌素的培养液保存的，但全部操作应在无菌条件下进行。

5. 第2d，在培养皿中加入1ml培养液。在培养早期，可观察到细胞仅从角膜缘处迁出，但没有细胞从角膜或虹膜迁出。无血清培养液含有低浓度钙离子（0.15mmol/L），减少胶原基质降解，故这种培养液可减少成纤维细胞长出。

6. 在植入角膜组织片后第5d，用镊子将组织片取出，再加入3ml培养液。取出组织片后，贴壁细胞继续增值。第2周，细胞生长形成单层，呈现上皮具有的典型卵石状排列特征。每个角膜约获得6×106 个上皮细胞。每周换液2次。

7. 扩增培养：取出组织片后，当细胞融合达70%-80%时，用PBS浸洗细胞。然后，在37℃条件下用胰蛋白酶-EDTA液处理4min。用含有10%FBS的PBS终止消化。将细胞离心后，用KGM混悬。计数细胞，以1×104个/cm2密度将细胞接种于涂有FNC的培养皿。在37℃、5%CO2 条件下培养。1d后换培养液。