细胞培养升级篇
细胞培养中的注意事项
1 冷冻管应如何解冻？
取出冷冻管后，须立即放入37 C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。
2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？
除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清， FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。
6 培养细胞时应使用5 %或10% CO2？或根本没有影响？
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2培养细胞。
7 何时须更换培养基？
视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
8 培养基中是否须添加抗生素？
除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。
9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应如何处理？
一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于-20 C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。
10 悬浮性细胞应如何继代处理？
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。
11 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。
12 细胞之接种密度为何？
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
13 细胞冷冻培养基之成份为何？
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 %原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。
14 DMSO之等级和无菌过滤之方式为何？
冷冻保存使用之DMSO等级，必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4 C，避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO之Nylon材质滤膜。
15 冷冻保存细胞之方法？
冷冻保存方法一：冷冻管置于4 C 30~60分钟 → (-20 C 30分钟) → -80 C 16~18小时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 C 至-80 C 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 C 不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80 C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
16 细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。
17 应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
18 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
加入相应抗生素，直接灭菌后丢弃之。
19 支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。
20 支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
21 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
22 CO2培养箱之水盘如何保持清洁？
定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
23 为何培养基保存于4 C 冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？
培养基保存于4 C 冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性，而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH 值。
24 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？
不同厂牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish或flask而有显著之生长差异。
25 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？
研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。
26 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于-80 C太久。
27 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？
冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。
28 如何选用特殊细胞系培养基？
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIM V（12005）培养基（SFM）。
29 L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
30 GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？
GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。
31 什么培养基中可以省去加酚红？
酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
32 培养基中丙酮酸钠的作用是什么？
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。
33 目录上说，Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？
HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。
34 二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？
二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。
35 当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。
36 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。
37 大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。
38 在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。
细胞培养常见问题的原因及对策：
1. 培养液pH值变化太快：
CO2张力不对。培养瓶盖拧得太紧。NaHCO3缓冲系统缓冲力不足。培养液中盐浓度不正确。细菌、酵母或真菌污染。
按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5％到10％。（2）改用不依赖CO2培养液。
松开瓶盖1/4圈。
加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。
在CO2培养环境中改用基于Earle's盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hank's盐配制的培养液。
丢弃培养物或用抗生素除菌。
2. 培养液出现沉淀，但pH值不变：
用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来。冰冻保存培养液。
用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌。
将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。
3. 培养液出现沉淀，同时pH 发生变化：
细菌或真菌污染。
丢弃培养物或用抗生素除菌。
4. 培养细胞不贴壁：
胰蛋白酶消化过度；支原体污染；培养液中无贴壁因子。
缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。
5. 悬浮细胞成簇：
培养液中含钙、镁离子。支原体污染。蛋白酶过度消化使得细胞裂解释放DNA。
用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。
分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物。
用DNase I处理细胞。
6. 原代细胞培养物污染：
原代培养组织在进入培养前已污染
培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织。
7. 培养细胞死亡：
培养箱内无CO2。培养箱内温度波动太大。细胞冻存或复苏过程中损伤。培养液渗透压不正确。培养液种有毒代谢产物堆积。
检测培养箱内CO2
检查培养箱内温度
取新的保存细胞种
检测培养液渗透压。注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260-350mOsm/kg。加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压。
换入新鲜培养液
8. 培养细胞生长减慢：
由于更换不同培养液或血清。培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。培养物中有少量细菌或真菌污染。试剂保存不当。
比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。
增加起始培养细胞浓度。
让细胞逐渐适应新培养液。
换入新鲜配制培养液。
补加谷氨酰胺或生长因子。
用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。
血清需保存在-5℃ 到-20℃。培养液需在2-8℃避光保存。含血清完全培养液在2-8℃保存，并在2周内用完。
接种细胞起始浓度太低，细胞已老化，支原体污染。
增加接种细胞起始浓度。
换用新的保种细胞。
分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。
血清
1. 保存血清最好的方法?
建议血清应保存在-5℃至-2O℃。然而，若存放于4℃时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。
2. 如何解冻血清才不会使产品质量受损?
建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。
3. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?
血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。
4. 为什么要热灭活血清?
加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。
5. 有必要做热灭活吗?
实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。
6. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?
GIBICO的胎牛血清没有预老化，储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。
7. 如何避免沉淀物的产生?
解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。
细胞分离试剂
1. 大部分连续细胞系，强贴壁细胞系，许多早代细胞
HBSS或无钙镁PBS
0.25％胰蛋白酶溶解在无钙镁平衡盐溶液中
2. 细胞表面蛋白完整性重要的连续细胞系
HBSS或无钙镁PBS
0.05％胰蛋白酶溶解在0.53mM EDTA
3. 弱贴壁表皮细胞转化成纤维细胞（要求细胞表面完整性），原代细胞
HBSS或无钙镁PBS
EDTA,甘油 溶解在柠檬酸钠中
4. 强贴壁早代细胞系
HBSS或无钙镁PBS
0.25％胰蛋白酶溶解在1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4单位/ml 溶解在PBS
5. 上皮细胞
0.5mM -1mM EDTA
0.5mM -1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4单位/ml 溶解在PBS
6. 强贴壁细胞，上皮细胞，一些肿瘤细胞
0.5mM -1mM EDTA
0.25％胰蛋白酶1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4单位/ml 溶解在无钙镁PBS
7. 厚培养物，多层富含胶原的密集培养
1mM EDTA
0.25％胰蛋白酶，200单位/ml胶原酶，1mM EDTA溶解在无钙镁平衡盐溶液中
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