大鼠间充质干细胞培养

一、细胞复苏和接种

1. 37℃预热大鼠间充质干细胞培养液（RM-001）和基础培养液（RM-001B）。

2. 从液氮中取出细胞产品管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。

3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭产品管外壁。

4. 将产品管中的细胞移至15 ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃ 基础培养液（RM-001B）4-5ml混匀，边滴加边摇匀。

5. 用1ml基础培养液（RM-001B）冲洗产品管，并将其转移到15 ml离心管中，边滴加边摇匀。

6. 轻轻混匀细胞后，取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀，从中取10 μl计数。 这一步骤非常重要，能确定您收到的产品是否合格（详见如何计数复苏的细胞）

7. 细胞悬液在1 000 rpm，室温条件下，离心5分钟，去除上清。

8. 加完全培养液4-5ml, 调整细胞量，轻轻混匀细胞，备用。

9. 按5 000-7 500细胞/cm2接种细胞。

10. 每个T25培养瓶中加完全培养液（RM-001）3-5ml， 后置于37℃、5%CO2 培养箱内培养。

二、细胞换液和培养

注意：复苏或传代后的细胞，请于24小时后，第一次更换培养液

1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2 培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后，请继续在37℃，5％CO2培养箱内培养。

2. 之后，每2-3天更换培养液1次，至细胞长至覆盖培养面的 80% 可进行传代或冻存。

3. 换液前，请将培养液从4℃中取出，使其恢复到室温。

三、消化细胞

1. 消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，用前按1：1混合。将PBS或D-Hank'S液, 消化液，含10% FBS的基础培养液回复到室温。

2. 具体操作如下：

（1） 吸去培养液，加入3 ml PBS或D-Hank'S液，使PBS或D-Hank'S液均匀的分布在培养瓶细胞表面。1分钟之后，吸去PBS或D-Hank'S液。

（2） 每个T25培养瓶加入消化液 2 ml，使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。

（3） 25℃消化2分钟，在显微镜下看细胞回缩成圆形后，轻轻震动使绝大部细胞脱落。

（4） 向每个培养瓶中加 3-5 ml 含10% FBS的 基础培养液(RA-001B) 中和胰酶的消化作用。

（5） 用吸管轻轻吹打培养面使细胞完全脱落后，吸至15 ml无菌离心管内。

（6） 20℃，1 500 rpm 离心 5分钟，弃上清。

（7） 加入一定完全培养液（RM-001)，调整细胞数量后，抽样加入胎盘蓝计数，得到细胞数和活性后，按细胞数传代或冻存。

四、细胞传代

1. 消化细胞（详见第三步）。

2. 按5000-7500个细胞/cm2接种细胞于T25的培养瓶中。

3. 每个培养瓶中加完全培养液（RM-001）3-5ml，后置于37℃、5%CO2 培养箱内培养。

五、细胞冻存

1. 调整细胞数5×105 /ml，加入一定量的基础培养液（RM-001B)。之后，配制等量的冷冻保护剂。

2. 冷冻保护剂的配制：FBS占80％，DMSO占20％

3. 将细胞悬液于冰浴中，慢慢逐滴加入冷冻保护剂，边滴加边摇动，加完后用轻轻吹打混匀。

4. 在冰浴中，将细胞分装于冻存管中，每管1ml或1.8 ml。

5. 将冻存管置于冻存盒(NALGENE Cat No. 5100-0001)内，放入-80℃冰箱中，24小时后转入液氮中保存。