兔膀胱平滑肌细胞的分离、培养和鉴定

一、摘要

目的：建立兔膀胱平滑肌细胞的分离、培养和鉴定的方法。方法：成年新西兰白兔两只（正常及梗阻各一只），采用酶法分离技术获得膀胱平滑肌细胞后于10%小牛血清的DMEM中培养，观察细胞形态和扩增情况，用爬片染色、电镜、蛋白质α-肌动蛋白（α-actin）鉴定细胞类型。结果：倒置显微镜下观察均呈“谷和峰”样结构、细胞爬片HE染色及电镜检查均证实为平滑肌细胞。免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应。从细胞爬片HE染色和免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应中我们发现该方法所的膀胱平滑肌细胞的纯度几乎99%。结论：该方法易行、可靠、在短期内可获得大量高纯度膀胱平滑肌细胞。

二、材料及方法

1、试剂及标本

成同龄雄性新西兰白兔2只，体重约2.5~3k(购于南京军区南京总医院动物实验中心)，一只为正常成年雄性新西兰白兔，一只为膀胱出口不全梗阻8周成年雄性新西兰白兔。DMEM、Ⅱ型胶原酶及α-肌动蛋白抗体（α-actin）购于北京华美公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；胰蛋白酶购于南京生兴公司。

2、 膀胱平滑肌细胞酶法分离

肌注盐酸氯胺酮200mg及氟哌利多5mg麻醉，待兔进入麻醉状态后消毒，下腹正中切口，迅速切取膀胱组织。超净台内依次庆大霉素溶液（浓度为100单位/毫升）、生理盐水及D-Hanks液中浸泡洗涤5分钟，然后放入D-Hanks液中除去黏膜、黏膜下及浆膜层。肌肉剪成肉糜后0.1%胶原酶（Ⅱ型2mg/ml）溶液40过夜消化（约10-12小时）。然后加0.25%胰蛋白酶370消化30分钟，消化液变混浊呈絮状提示消化良好。用100目细胞筛过滤该絮状液，混悬液离心（1000转/分，离心半径13cm）5分钟，沉淀的细胞移入培养皿，加入含10%胎牛血清的DMEM，置于50ml/L CO2、370饱和湿度孵育箱中静置培养，培养液每周更换2-3次。

3、传代培养

待培养的细胞通过增殖达到约80%汇合状态时做传代处理。弃去原培养瓶中的旧培养液，加入适量的PBS(因培养液中的胎牛血清对胰蛋白酶有抑制作用)，轻轻摇动，清洗残留的培养液后弃之。加入适量的消化液，使其覆盖整个细胞，将培养瓶放置于CO2培养箱，不时在倒置显微镜下观察，当细胞胞质回缩，胞间间隙增大后，吸出消化液，并向培养瓶中加入含10%胎牛血清的培养液终止消化。用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁制备细胞悬液，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。细胞进行计数后，按照1X105~106密度将细胞接种于培养瓶中。

4、培养细胞的观察及鉴定

采用倒置显微镜观察平滑肌细胞的形态及生长情况。细胞爬片HE染色观察细胞形态。电镜检查。免疫组化染色检测α-actin。

结果

两只兔所有标本均获成功。倒置显微镜观察平滑肌细胞24小时均可见膀胱平滑肌细胞贴壁生长，正常兔7天左右、而梗阻兔则需10~12天可于50毫升培养瓶约80%汇合。均传代顺利，传代后约正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9天可于50毫升培养瓶约80%汇合。本组中均传至第8代，经第8次传代后，平滑肌细胞仍生长迅速，未见衰老迹象。倒置显微镜下观察均呈“谷和峰”样结构（图1 对照组2周的细胞；图2 实验组培养2周的细胞）。细胞爬片HE染色见膀胱平滑肌细胞细胞核呈两端钝圆的卵圆形平滑肌细胞核型。电镜检查可见平滑肌细胞密班结构。免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应。从细胞爬片HE染色和免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应中我们发现该方法所的膀胱平滑肌细胞的纯度几乎99%。