原代细胞培养技术

一、组织块直接培养法

1、取材，用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

2、用手术剪将组织剪切成1mm3 左右的小块，再用Hank's液洗三次。

3、将组织块转移至培养瓶，并贴附于瓶底面。

4、轻轻将培养瓶翻转，瓶底朝上，向瓶内注入适量的培养液，将培养瓶放置在37℃恒温箱内培养。

5、放置待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。

二、消化培养法

1、取材，用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

2、用手术剪将组织剪切成1mm3 左右的小块，再用Hank's液洗三次。

3、视组织块量加入酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

4、加入3—5ml培养液以终止酶消化作用（或加入相关酶抑制剂）。

5、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

6、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。

7、加入Hank's液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

8、加入培养液1—2ml（视细胞量），血球计数板计数。

9、将细胞转移到培养瓶中，37℃下培养。

三、 器官培养

1、将不锈网做成支架形状，调整其高度至培养皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5μm孔径滤膜。

2、将培养液加入培养皿中，使液面刚刚接触到滤膜，但不要使其浮起。

3、将要培养器官组织放在滤膜上，一般厚度不要超过200μm，水平面积不超过10mm2 。

4、将上述准备好的培养物放入CO2 培养箱，并加注氧气调整氧分压，最好到90%。

5、培养过程中要注意观察培养液平面，尽可能保持在与滤膜一致的水平上。

6、上述可进行器官培养1-3周，每2-3天换液一次，并根据情况做进一步实验和检测。