小鼠成骨细胞的培养和传代

原代培养

1.取新生3d以内BALB/c小鼠，断颈处死后立即投入75%酒精中消毒5min（虽有头部皮肤保护，但时间不要过长，所以事先要把准备工作做好之后再去杀老鼠）。

2.D-Hank’s液漂洗后分离颅盖骨，刮除骨膜和结缔组织，DMEM清洗颅骨骨片并剪碎。（自我感觉碎一点好一些）

3.加入0.25%胰蛋白酶（含0.02EDTA），37°恒温消化20min，吸出消化液，之后1mg/1mlI型胶原酶37°恒温消化20min后离心（1000r/min，5min），弃上清液。（消化时间自己摸索，之前我消化30分钟，但最后发现消化30min后悬浮未贴壁细胞较多，于是降低了胰酶消化时间，增加了胶原酶消化时间），

4.加入含15%血清的DMEN培养基，吹打骨片（力气不要过大，但要吹打次数多一下，尽量使细胞从松解得骨片上脱落），将细胞悬液接种于培养瓶中，置于37℃ CO2恒温孵育箱中培养。

传代培养

1.弃除旧的培养液（可以吸，可以倒，倒的时候小心）

2.用PBS冲洗一遍（加PBS清洗或换液时，主要反拿培养瓶加液，不要将细胞冲刷下来）

3.用0.25%的胰酶消化液消化30-45s，在显微镜下观察，细部变圆，间距增大时，可用手拍打瓶侧壁与底壁，会发现细胞很快悬浮（如果拍打的话，下一步注意千万不要弃去消化液，如果不拍打，可以弃去）

4.加入含15%的牛血清培养液终止消化

5.用吸管反复细心吹打瓶底，置离心管中后，可以用PBS或D-HANKS再吹打，可以反复几次，目的是将细胞尽可能的洗刷干净（用PBS或D-HANKS目的是省钱，呵呵培养基也可以，不过money多，而且易产生气泡）

6.离心