凋亡和细胞周期调控相关基因的应用

前言

通过引入小干扰RNA（siRNA），靶向基因抑制的系统性高通量功能性基因组筛选表现为一种生物学功能分析的极有效方法。 这种筛选通常产生大量的“阳性”，即在所研究的特殊生物学功能中可能起作用的基因。

但是，区别真假阳性以及仔细评估基因在所分析条件下的作用机制却很困难。这些分析经常用细胞凋亡或细胞周期中的变化作为表型/功能的检测结果。但是，这些重要细胞代谢过程中的变化可以由许多不同途径所引起。为了更深入地了解基因抑制如何导致细胞凋亡或细胞周期方面的变化，对这些过程相关其他基因表达的分析非常有用，因为这有可能阐明有关的途径，并确定功能基因网络。

我们在HLR-CHOP细胞中进行siRNA筛选，以确定控制细胞周期调控和凋亡的基因。在两种筛选中，通过转染siRNA而下调基因，在细胞周期分析中在7-AAD染色后用流式细胞术分析对DNA内容的影响，在凋亡分析中分析对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3激活的影响。

在细胞周期分析中，通过RNAi对DONSON和GDF3的下调导致细胞周期G1期的阻断。为了描述这两个基因在细胞周期调控中的进一步作用，我们在抑制DONSON和GDF3基因后用qRTPCR分析了一组91个内源性表达的细胞周期基因。为此我们使用LightCycler® 480实时荧光定量PCR仪和RealTime ready细胞周期检测预制多孔板。用特异抗体和流式细胞术测定天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的激活。

在这个分析中，我们发现C24ORF17和BARD1基因下调后，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的激活增加了。为了确定编码蛋白在凋亡诱导中的作用，在本研究中我们使用RealTime ready凋亡检测预制多孔板和LightCycler® 480仪器，通过qRT-PCR分析了当通过RNAi而表达量下调时，C24ORF17和BARD1对凋亡调控有关的一组378个基因的影响。

进一步试验了已经在细胞周期检测预制多孔板中分析过的DONSON和GDF3基因对19个管家基因的RealTime ready参照基因检测板的潜在影响，然后利用对于管家基因的分析结果进行实验数据的标准归一化。 此外，对所有检测板，在所分析基因在转染siRNA后的内源性表达方面的变化与作为对照的转染siRNA靶向GFP的HeLa细胞中的表达进行比较。

材料和方法

细胞培养

HLR-CHOP细胞（Stratagene）在37℃ ，5% CO2条件下，保存于加有1%左旋谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、 10% FBS（GIBCO-BRL）、潮霉素（100μg/ml）和G418（geneticin，250μg/ml）的DMEM（GIBCO-BRL）中。 用40 nM siRNA转染细胞，转染48小时后，用TNF-α（33 ng/ml）刺激细胞。

RNA分离和逆转录

用RNeasy试剂盒在两个独立反应（每个siRNA 2个生物学重复）中从1×107 HLR-CHOP细胞提取总RNA。

每次用700 ng总RNA，以及根据厂家指导手册采用寡脱氧胸腺核苷酸（dT）18和随机六聚体引物的混合物的Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒，在独立反应中进行第一链cDNA合成。

qRT-PCR

以20μl反应量、96孔格式和10μl反应量、384孔格式，用LightCycler®480仪器和2× LightCycler®480 Probes Master，用RealTime ready分析方法进行qRT-PCR。在96孔格式中采用每次反应10 ng的cDNA/RNA浓度，在384孔格式中采用每次反应4 ng的浓度。LightCycler?480的反应条件设置为：95℃ 10分钟；95℃ 10秒钟，45个周期；60℃ 30秒钟；72℃ 1秒钟；然后是40℃ 30秒钟的最终冷却。