凋亡细胞对胰蛋白酶和核糖核酸酶敏感性分析法

如将活细胞与一定浓度的胰蛋白酶和核糖核酸酶温育，短时间内对细胞的形态、功能和活力几乎没有影响， 但坏死细胞以及细胞浆膜受到损伤的晚期凋亡细胞则可被这两种酶降解，使用流式细胞仪分析，可通过提高光散射、核酸或蛋白质荧光信号的阈值排除晚期凋亡细胞和坏死细胞，测定早期凋亡细胞。

【材料与试剂】

（1） 含Ca2+ 和Mg2+ 的Hanks平衡盐溶液（HBSS）：取1份A液（160g NaCl，8g KCl，2g MgSO4 ?7H2 O，2g MgCl2 ●6H2 O，2.8g CaCl2 溶于双蒸水，定容至1000ml）和1份B液（3.04g Na2 HPO4 ?12H2 O，1.2g KH2 PO4 ，20g葡萄糖，溶于双蒸水，定容至1000m）与18份双蒸水混合，调节pH至7.2~7.4，高压灭菌后，于4℃保存备用。

（2） 0.5%胰蛋白酶，HBSS溶解后分装，于-20℃保存。

（3） 200mg/ml核糖核酸酶，HBSS溶解后分装，于-20℃保存。

【操作步骤】

（1） 于4℃离心收集细胞并重新悬浮于0.2ml HBSS中， 使其浓度位106 /ml；

（2） 加入100ml核糖核酸酶，混匀，37℃作用15分钟；

（3）加入100ml胰蛋白酶，混匀，37℃作用30分钟；

（4） 加入含10%小牛血清的HBSS，混匀，使胰蛋白酶灭活，4℃离心，去上清；

（5） 以HBSS洗细胞一次， 收集细胞并重新悬浮于HBSS中；

（6） 按本章介绍的其他方法， 进行凋亡细胞的染色和流式细胞分析；

【结果分析】

经过胰蛋白酶和核糖核酸酶的消化，去除了坏死的、受机械损伤的以及凋亡晚期的细胞，剩余细胞大部分是PI拒染的细胞，包括活细胞和凋亡早期的细胞。因此，本法适用于测定凋亡早期细胞以及未产生DNA断裂的凋亡细胞。

【注意事项】

当欲研究活细胞的表型时，要注意选择酶消化的最适时间， 因为胰蛋白酶可能会使活细胞表面抗原决定簇丢失。但经过胰蛋白酶处理的细胞，在培养基中培养数小时后，可使大部份表面抗原得以恢复。