Login
欢迎浏览恩派尔生物资料网
我要投稿 请登录 免费注册 安全退出

您现在的位置是: 首页 > 仪器相关 > 仪器资料

仪器资料

HPLC 方法开发中常见的问题与解决方案

2024-09-10 仪器资料 加入收藏
目前在所有的色谱分析中 HPLC 是应用最为广泛的一种分析方法。HPLC 主要应用在医药、食品、环保、化工等领域。而在 HPLC 方法开发过程中, 我们经常会遇
目前在所有的色谱分析中 HPLC 是应用最为广泛的一种分析方法。HPLC 主要应用在医药、食品、环保、化工等领域。而在 HPLC 方法开发过程中, 我们经常会遇到各种各样的问题,今天小编就给大家总结一下在 HPLC 方法开发过程中常见的问题和一些处理方法。

 



 

HPLC分析流程

 

 

一、梯度洗脱条件的设置

 

典型的梯度洗脱是用两种溶剂做流动相,弱溶剂 A 和强溶剂 B,在反相色谱分离中溶剂 A 大都是水,溶剂 B 是甲醇或者乙 jing 等强溶剂。所有的梯度洗脱中溶剂强度不断增加,即 B 的浓度不断增加。例如, 流动相中溶剂 B 的含量在一定时间内梯度从 20% 提高到 80%。梯度控制器决定流动相的组成,可通过输入不同的条件实现:

①流动相 (梯度洗脱开始时): cB(%);

②流动相 (梯度洗脱结束时): cB(%);

③从分离开始到结束的梯度时间;

④梯度形状;

 

等度洗脱、线性洗脱、梯度洗脱分离效果

 


 

二、负峰的消除

 

从方法原理上讲, 当样品池的吸收值低于参比池时可产生负峰现象, 因此要求用流动相

溶解样品或稀释样品。当分析物为两性化合物时,由于样品本身极性较大,且化合物结构中含有氨基,极有可能与检测池壁产生相互作用, 产生负峰现象,这种情况下需要在流动相中加入 NH4+来减少负峰现象。

 


三、进样量对分离效果的影响

 

一般在保证灵敏度的前提下应尽量减少进样量,以避免可能发生的溶剂效应。特别是于样品性质的特殊性不同,导致溶解样品的溶剂与流动相组成不同时更应注意该问题,需要保证每次的进样量在 1μL-5μL。例如,在做靛蓝、靛玉红分析时, 对照品及样品溶液为氯 fang 溶液, 流动相为甲醇/水 (70:30), 当进样量为 20μL 时, 色谱系统会出现异常峰, 再次将进样量改为 10μL 时则出峰正常。

 


四、含有氨基结构化合物的峰拖尾问题

 


具有-NH2: 结构的物质多呈碱性, 特别在酸性条件容易形成一 NH3 十, 若采用以硅胶为基质的键合填料如 C18、C8 等进行分析时, 由于色谱柱硅胶填料本身存在硅羟基 (-Si-OH), 二者会相互作用导致拖尾, 从而影响到方法的可重现性。解决的方法是可以同流动相中加入 0.05 一 0.1mol/L 的硫酸铵。硫酸铵为中性盐, 加入后不会导致流动相 pH 值大的变化, 而且可以解决一些-NH2 碱性化合物的峰不对称问题。

 



氨基化合物拖尾峰

 


五、流动相中甲醇与乙 jing 的选择

 

常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙 jing。乙 jing 虽然价格很高,毒性比甲醇大,但是洗脱能力比甲醇强,很少与样品发生反应,用作流动相系统常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙 jing,甲醇有其性价比的优势,但是甲醇活性高,可能与某些样品发生反应,而且甲醇在低波长下有紫外吸收,会降低分析方法的灵敏度。

Thermo ScientificTM ChrompleteTM 色谱通溶剂,一瓶通用。适用于多种应用:

  • HPLC: UV、UV-Vis、PDA、ECD、FL 或 RI 检测器  

  • GC: FID、ECD 或 TCD 检测器  

  • 紫外分光光度法

  • 萃取、纯化和超临界流体色谱

  • 优势--兼容多种应用场景,减少实验室所需的试剂瓶数量,大大简化库存管理并减少试剂浪费。

 

六、流动相的PH问题

 

利用反相色谱法分离弱酸(3 ≤ pKa ≤ 7)或弱碱(7 ≤ pKa ≤ 8)样品时,可以通过调节流动相的 pH 值,以抑制样品组分的解离,从而增加组分在固定相上的保留,并改善目标化合物的峰形。对于弱酸性化合物来讲,流动相的 pH 值越小,组分的 k 值越大;当 pH 值远远小于弱酸的 pKa 值时,弱酸主要以分子形式存在。分析弱酸样品时,通常在流动相中加入少量弱酸,常用 50 mmol/L 磷酸盐缓冲液和 1% 醋 suan 溶液;分析弱碱样品时,通常在流动相中加入少量弱碱,常用 50 mmol/L 磷酸盐缓冲液和 30 mmol/L 三乙 an 溶液。注:流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅羟基的强相互作用,减轻或消除峰拖尾现象。


文章底部广告位

文章评论

加载中~