反相高效液相色谱（RP-HPLC）是目前应用最广泛的一种分析方法，具有分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，应用范围广等特点，约占目前 HPLC 分析应用的 80%。RP-HPLC 固定相主要包含非极性烷基烃，例如与二氧化硅或其他惰性载体结合的 C8 或 C18 链。C18 和 C8 是指色谱柱键合相的烷基链长度。链长影响吸附剂相的疏水性，从而增加配体的保留。C18 比其他反相更具疏水性（非极性更强）的原因是碳链的长度更长。而在反向高效液相色谱（RP-HPLC）分析的过程中，选择合适的流动相往往可以控制样品的保留时间和分离度（图 1）。
流动相的性质包括有机溶剂的种类、混合比例、添加剂和 pH 值等，这些因素对分析实验结果产生着不可忽视的作用，因此选择合适的流动相对于液相色谱的分析至关重要。在反相高效液相色谱中，一般来讲，流动相 B 是有机溶剂，常用于泵的流动相混合和梯度洗脱；流动相 A 主要是水，通常也会含有少量控制 PH 和离子强度的改性剂或缓冲盐等。
图 1 RP-HPLC 中流动相与固定相之间的相互作用
一、有机相的种类与混合比例
有机相是反相高效液相色谱系统流动相重要组成部分，对 HPLC 分离起到重要作用。比较常见的反相高效液相色谱系统的有机相有：C2 H3N、甲醇、C4 H₈O 等。洗脱强度的顺序是甲醇。（表 1）
表 1 有机相的洗脱强度
例如，在实际应用中，我们会发现洗脱效果 44% 甲醇/水 = 35% C2 H3N/水 = 28%= C4 H₈O/水。虽然 C4 H₈O 的洗脱效果比较好，但是由于 C4 H₈O 的毒性和安全性问题，导致其在实验过程中应用的比较少。而日常实验中应用最多的有机溶剂是 C2 H3N 与甲醇，两者比较而言，C2 H3N 洗脱强度高、粘度低、紫外干扰弱，但是价格较贵；甲醇洗脱强度不如 C2 H3N、粘度高、在 210nm 以下有着显著的紫外吸光度，但是甲醇价格较便宜。
一般在初始分离条件中，有机溶剂的比例定为 80%，然后逐步减少有机相比例，直到保留因子（k）落在所期望值的范围内，即 1 ≤ k ≤ 10，再考虑分离度、拖尾因子和出峰时间等因素，优化出合适的流动相比例。当单独使用 C2 H3N 和甲醇或单一有机溶剂不能达到洗脱效果时，就应该要考虑有机溶剂的混合使用。若等度洗脱不能有效分离样品时，就要考虑梯度洗脱的方法。但是使用梯度洗脱时，流动相有机溶剂最高比例不得大于 90%。
二、水相与缓冲盐的选择
2.1、水相的选择
一般化合物可以用纯水作为水相，HPLC 用水除满足药典的要求外，还要求电导率不得小于 18MΩ·cm（25℃ 时），TOC 不得大于 0.5 mg/ml，在 190nm、200nm 和 250～400nm 的吸收度分别不得大于 0.01、0.01 和 0.05。使用前需经过 0.22μm 滤膜过滤。在液相分析过程中，从样品和标准制备到柱冲洗和洗脱都需要用到纯水，这也使水成为 HPLC 分析过程中消耗量最大的试剂。而水作为实验分析中常用的试剂，虽然常见，但水的纯度也往往是实验成功与否的关键。（图 2）因此，使用高纯度的实验用水对于色谱分析结果至关重要，色谱仪除了要确保有机溶剂、标准液和其他 HPLC 流动相成分的纯度外，还必须确保试剂用水的水质良好，没有任何污染物。
图 2 在 C18 色谱柱上进行梯度洗脱。以超纯水为流动相 A，C2H3N 为流动相B。结果显示，水的纯度越高，紫外吸收干扰越小
2.2、PH 调节剂和缓冲液
在涉及到药物分析时，由于大多数药物是可电离的，即酸性、碱性或两性离子。因此，必须控制流动相 A 的 pH 值，因为 PH 值会对溶质的分离产生显著影响。一般情况下需要通过在水中加入 PH 调节剂或者缓冲盐来调节流动相的 pH 值，从而达到抑制样品组分解离的目的。
常见的缓冲液和调节 PH 的试剂有磷酸盐缓冲液、铵盐缓冲液、C2 HF3O2、甲酸和乙酸等。而缓冲盐溶液在 HPLC 泵头内极易出现高压盐析现象，磨损密封垫，所以一般将缓冲盐浓度选定在样品浓度的 2～5 倍，大致为 5～50 mM。
2.3、离子对试剂的选择
离子对试剂主要用于离子型样品和极性较大，在反相色谱系统中不易保留的被分析物。当根据反相色谱方法初步摸索确定必须要使用离子对试剂时，首先根据化合物峰的酸碱性（通过改变 pH 来判断）确定添加哪种类型的离子对试剂；然后加入一个初始浓度的离子对试剂；最后通过改变流动相 B% 或者温度、流动相 pH 及离子对试剂浓度进行调整选择性。在流动相中添加离子对试剂可以改善碱性物质色谱峰的拖尾，增加原本保留很弱的酸性或者碱性离子化合物的保留（并且 K 值合理）。这和反向色谱法中改变流动相 pH 导致化合物的保留时间变化性质差不多，但是离子对色谱法能够更好的控制酸性或者碱性化合物的保留时间和分离度，而且无须将流动相 pH 调整到极端的水平（pH 小于 2.5 或者大于 8）。
图 3 IPC 离子对试剂工作原理。通过与流动相中的离子对试剂相互作用来改变分析物的极性。
