如何分离成纤维细胞？

下述的通用操作方案适用于小鼠、大鼠、仓鼠和鸡胚胎。选择大约一半足孕时间的胚胎最好，10 ~ 13 天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。

• 胚胎的分离

适用哺乳动物（仓鼠、小鼠和大鼠）

1. 采用认可的方案处死啮齿动物

2. 立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。若可能，置紫外灯下照射5分钟

3. 用无齿的摄子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌摄子将皮肤扯向后腿

4. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无团的培养皿上

5. 剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS 的烧瓶中

6. 漂洗胚胎，去掉PBS，继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止

适用鸡胚胎

1. 用70 ％乙醇擦洗鸡蛋壳

2. 用无菌剪刀轻敲鸡蛋的圆端，轻轻去除蛋壳露出气囊

3. 用无菌镊子去除覆盖于绒毛尿囊上的白膜

4. 剪开包膜，用弯镊夹住胚胎颈部取出胚胎

5. 弃头部，将无头的胚胎置于广口烧杯中，用PBS漂洗

• 将6~8 个胚胎转移至一个小的无菌广口烧杯中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎，用PBS 漂洗

• 在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于-500ml 的无菌的有搅拌棒的烧杯中加入200 ~ 300ml 用HBSS 配制的0.25 ％的无菌胰蛋白酶（ GIBCO/BRL)

• 在温暖的环境中或置于37℃ 培养箱中轻轻搅动15 分钟

• 让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌大容积的离心管中，该管内按照每10ml 上清加人1mI 牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶

• 加人新鲜胰蛋白酶溶液于含有残留未消化组织块的500ml 烧杯中。重复步骤4 和5

• 离心混合的细胞悬液， 1200r/min， 5 分钟，弃上清。

• 用新鲜的无菌PBS 重悬沉淀的细胞，按步骤7 再次离心

• 用PBS 反复洗涤细胞直至上清清亮为止

• 用含有10% 牛血清和抗生素（如青霉素、链霉素）的DMEM (GIBCO/BRL) 10ml 再悬沉淀，并使终体积为l00ml

• 让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降

• 为确定现有细胞浓度，加入0.2ml 细胞悬液于1. 8ml  1％醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数

• 按每10-mm 平皿 l x107至4 X 107细胞的数量接种于l0ml 组织培养液中，在饱和湿度的37℃ CO2 培养箱中孵育直至细胞铺满

• 当细胞长满后，去除培养液，用I0％的温暖的Versene（用PBS 配制的0.53mmol .lEDTA, GIBCO/BRL）洗涤细胞层2 次

• 弃Versene，加入相同体积的温暖0.05% 胰蛋白酶-EDTA (GIBCO/BRL)

• 37℃孵育 5 分钟

• 用无菌吸管轻轻吹散细胞，并转移至含l ~ 2ml 血清的无菌管

• 离心: l200r/min. 5 分钟，弃上清

• 再悬沉淀于5ml 培养液中，另加人15ml 培养液，分装于 2 个I00-mm平皿中

• 置37℃ 饱和渐度的CO2培养箱中培养细胞，直至细胞长满，继续步骤14 ~ 20以传代细胞