CHO细胞无血清培养

1、CHO细胞

CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)，该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。全世界批准正式应用于人类疾病治疗或疾病预防的基因工程产品约有三十多种，其中只有一种(乙肝疫苗)是由酵母菌生产的，其余所有产品都是由CHO细胞和大肠杆菌生产的，大肠杆菌不能形成有活性的二聚体(如白介素2)，也不具有糖基化的功能(如EPO)，而CHO却具有如上的功能，因此CHO成为表达复杂生物大分子的理想宿主。另外CH0细胞在基因工程使用中还有一个优点，该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利。

2、CHO细胞血清培养

传统上CHO细胞的培养都是在DMEM／F12基础培养基中添加5~10的小牛血清(用于重组蛋白)或胎牛血清(用于杂交瘤生产)单抗来完成的，血清除了供给细胞的营养成分外，还能促进细胞开始合成DNA，对细胞的增殖有很大的作用。

实验证明，血清在细胞的体外培养中提供了细胞增殖所必需的生长因子。但哺乳动物的血清价格昂贵，成本高不适于今天的大规模工业化生产。而且哺乳动物血清作为补加物，存在许多问题，首先血清的来源存在问题，血清来源于特定的地区，因而如果该地区发生灾荒或牛群中流行疾病，都可导致血清失去供应源。血清批量之间的差异大，重复性差，由于血清来源于动物，动物个体或群体的差异及时间上的差异都能导致每个批号的血清不完全一样。

从重组蛋白生产的角度来看，出于Q和Qc的要求，每换一个批号的血清，都包含大量的验证工作，这就给生产带来很大的麻烦。另外血清来源于动物因此经常被污染，污染的血清往往导致细胞生长缓慢，蛋白产量下降，甚至导致细胞死亡。目前购自各大公司的血清虽能消灭细菌和所有支原体，但很难保证除去所有的病毒污染。

血清的成分十分复杂，经研究表明，血清除含有促进生长的活性成分外，还含有一定的细胞毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作用，影响细胞功能的表达 血清复杂的成分也给基因工程表达产物的下游工作带来很大的困难，因此成分明确，价格经济的无血清培养基成为CHO细胞培养的一种必然需求。

3、CHO细胞的无血清培养基

从血清培养所面临的问题，我们不难看出：人们急切地需要找到能够替代血清的物质，从而解决血清培养所面临的这一问题。五十年代起，科学家就开始研究无血清培养基。要发展无血清培养基，必须找到适当的具有血清功能的因子，由于血清的成分不清而且十分复杂，具有多种促进细胞生长和增殖的因子，因此要找到血清替代物是相当困难的。

人们已经发现一些物质单独或一起使用可以替代血清。这些物质分别是微量元素、生长因子、激素、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制剂。微量元素是细胞代谢所必需的，是无血清培养基的主要添加物之一，铁、锌、硒等都是不可缺少的，有些资料证明还需要铜、锰、钼、钒等元素，这些元素在血清培养中由血清提供，在无血清培养中需要补加。促生长因子是无血清培养基的主要补加物之一。

现在研究者已经从血清、各种组织和生物成分中用生物工程的方法，制取了各种促细胞生长物，如表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板生长因子(PDGF)、生长调节素(SM)等。现已证明很多激素具有促进细胞生长的作用，胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，无血清培养基缺乏对细胞的保护，血清培养残余的胰蛋白酶对血清的损伤十分严重，因而无血清培养基必须添加酶抑制剂。脂类是细胞膜的主要成分，添加脂类可以促进细胞增殖，随着无血清培养基研究的进一步深入，无血清培养基将越来越完善。

无血清培养试验步骤

1、实验材料

CHO细胞株购于俄罗斯Soym Agromed，无血清培养基(CHO-S-sFM1I)购于Gibeo公司。

2、实验方法

（1）无血清培养基的配制

用90ml纯水溶解制备1升量的袋装Gibeo CHO-S-sFM1I，加人2.45g NaHC03，用 1N NaOH将pH调为8.0，再用1N HC1调回至pH7.1，定容后用0.22μm滤器过滤除菌。

（2）CHO细胞的适应

用含血清的常规培养基和无血清培养基1:1(v/v)悬浮细胞，接种量为3×105个/ml。在37℃，8％培养箱中培养，使细胞密度达5×105个/m1。然后用等体积的CHO-S-sFM1I 将细胞稀释到3x 105个/ml，继续培养，重复上述操作，直至血清浓度降为0.1％后，用完全无血清培养基培养到3×106个/ml。再以3×l05个/ml接种，传50代，至此完成适应工作。

（3）细胞计数参阅《组织培养技术4》的方法，用血球计数板计数。

（4）CHO细胞表达EPO水平应用MIT比色法测定。

4、无血清培养基的发展

目前的无血清培养基已进入第三代，第一代无血清培养基虽然不含有血清，但含有大量的动物或植物蛋白，如BSA或激素等，虽然它所含的总体蛋白要低于血清，但蛋白的含量依然很高，八十年代末，九十年代初，研究人员开发出了第二代无血清培养基，它完全不用动物来源的蛋白，如 LTI公司生产的 CH0～S—SFM I，它采用悬浮的CHO表达蛋白，培养基蛋白含量很低(少于100~g/m1)，使重组蛋白的纯化简单，目前市售的无血清培养基主要是这一类。第三代无血清培养基现在已经出现，它完全不含有蛋白或含量极低，如 LTI公司最近推出的CHO—I—PFM，培养基不含任何蛋白质，没有任何动物、人类蛋白或多肽，为表达产品的下游处理工作提供极大方便。

目前无血清培养基的价格还很高，不亚于大规模的工业化生产，因此降低无血清培养基的成本，开发出无血清、无蛋白、低成本的无血清培 养基日益受到人们的重视。随着生物工程产品的开发和推广，它的应用愈来愈广泛，相信在将来的生物制药行业它将具有广阔的市场前景和应用空间。