细胞铁死亡实验方法

一、实验准备

‌【1】细胞培养‌：选择适当的细胞系进行培养，如肿瘤细胞系。将细胞接种于培养皿中，在37℃、5% CO2的培养箱中培养至适宜密度。

【2】实验试剂‌：准备铁死亡诱导剂（如Erastin、RSL3）、铁死亡抑制剂（如Ferrostatin-1）、荧光探针（如FerroOrange、Mito-FerroGreen）、GPX4活性检测试剂、ROS检测试剂、脂质过氧化检测试剂等。

二、铁离子检测

铁离子在细胞铁死亡中扮演关键角色。铁离子的检测方法包括：

→普鲁士蓝染色‌：使用普鲁士蓝染色剂对细胞进行染色，观察细胞内铁离子的分布和含量。

‌→荧光探针检测‌：使用亚铁离子探针（如FerroOrange）或线粒体亚铁离子探针（如Mito-FerroGreen）对活细胞进行荧光成像，检测细胞内Fe2+的水平。

→比色法检测‌：
使用Iron Assay Kit-Colorimetric试剂盒，通过比色反应检测组织裂解液中的铁离子含量。

三、脂质过氧化检测

脂质过氧化是细胞铁死亡的主要特征之一，脂质过氧化的检测方法包括：

‌①特异性荧光探针检测‌：使用特异性荧光探针（如DCHF-DA）对细胞进行半定量分析，检测ROS和脂质过氧化物的水平。

‌②ELISA和TBAR检测‌：使用ELISA和TBAR方法检测脂质ROS下游副产物（如4-HNE蛋白质加合物和MDA）的含量。

③抑制剂协同分析‌：利用特异性抗氧化性铁死亡抑制剂（如Ferrostatin-1）进行协同分析，观察抑制剂对脂质过氧化和细胞死亡的影响。

四、线粒体形态及功能检测

线粒体在细胞铁死亡期间发生显著变化。线粒体形态及功能的检测方法包括：

⒈透射电镜观察‌：使用透射电镜观察线粒体的形态变化，如线粒体萎缩、变小、膜密度增加等。

‌⒉线粒体膜电位检测‌：使用JC-1等线粒体膜电位试剂盒检测线粒体膜电位的变化。

⒊线粒体标记物检测‌：使用线粒体标记物（如MitoScene Green I）检测线粒体的形态和分布。
五、细胞活力及细胞死亡检测

细胞铁死亡导致细胞活力下降和细胞死亡。细胞活力及细胞死亡的检测方法包括：

‌①MTT或CCK-8检测‌：使用MTT或CCK-8试剂检测细胞的活力，观察铁死亡诱导剂对细胞活力的影响。

②凋亡小体检测‌：使用荧光显微镜观察细胞是否形成凋亡小体，以区分细胞凋亡和铁死亡。

③细胞形态观察‌：使用显微镜观察细胞的形态变化，如细胞膜破裂、细胞裂解等。

六、实验结果分析

根据以上检测结果，综合分析细胞内铁离子水平、脂质过氧化程度、线粒体形态及功能变化、细胞活力及细胞死亡情况，判断细胞是否发生铁死亡及其程度。

细胞铁死亡实验方法涉及多个关键步骤，包括铁离子检测、脂质过氧化检测、线粒体形态及功能检测以及细胞活力及细胞死亡检测等。通过综合分析这些检测结果，可以判断细胞是否发生铁死亡及其机制。
细胞铁死亡作为一种新型程序性细胞死亡方式，在疾病研究中的重要作用逐渐被揭示，为疾病治疗提供了新的思路和方法。