TUNEL检测实验报告（二）

一、   实验样本及分组

样本：大鼠脑

二、 实验结果

三、实验结论

凋亡/阳性细胞呈深棕色。
四、实验材料

1. 主要仪器

2.主要试剂

一、 实验原理

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180~200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上生物素标记的dUTP，在DAB的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），从而可以通过显微镜检测细胞凋亡的情况。
二、方法步骤

1.脱蜡

1)   65℃烤片2 h；

2)   二甲苯（I）中脱蜡10 min；

3)   二甲苯（II）中脱蜡10 min；

4)   100%乙醇（I）中5 min洗去二甲苯；

5)   100%乙醇（II）中5 min洗去二甲苯。

2.水化

1)   95%乙醇中水化5 min；

2)   85%乙醇中水化5 min；

3)   75%乙醇中水化5 min；

4)   蒸馏水中水化待用。

3.通透

1)   蛋白酶K修复：每个样本上滴加100 μL蛋白酶K工作液，37℃反应30 min；

2)   PBS浸洗3次各5 min。

4. 标记

1)   每样滴加50μL的Tunel反应混合物，37℃避光孵育60 min；

2)   PBS充分浸洗3次各5 min；

3)   每个样本滴加50 μL converter-POD工作液，湿盒中37℃避光反应30 min；

4)   PBS充分浸洗3次各5 min。

5. 显色

1)   根据说明书配制DAB显色液；

2)   每个样本滴加50 μL DAB显色工作液，室温显色30 s；

3)   蒸馏水稍洗终止显色。

6.复染

1)   苏木素染色30 s；

2)   流水冲洗2 min。

7.分化返蓝

1)   1%盐酸酒精分化2 s；

2)   流水冲洗切片5 min。

8.脱水

1)   蒸馏水过洗1~2 s；

2)   85%乙醇脱水5 min；

3)   95%乙醇脱水5 min；

4)   无水乙醇脱水5min；

5)   无水乙醇脱水5 min。

9.透明

1)   二甲苯（I）透明5 min；

2)   二甲苯（II）再次透明5 min。

10.封片

1)   在石蜡切片的中央滴加适量中性树胶，盖上盖玻片封固；

2)   在通风橱内室温晾干。

11.镜检

1)  显微镜下观察拍照。