荧光原位杂交检测实验报告（三）

一、实验目的

用原位杂交技术在原位研究组织细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。

二、实验样本及分组

样本：BC53、BC53B、BC54、BC54B

检测指标：has-circ-ST6GALNAC6

三、实验结果

1.探针工作信息

2. 染色结果

四、实验结论

DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素（488）标记的绿光。mRNA原位杂交显示结果理论为胞浆阳性，少数核阳性属正常。micRNA与lncRNA不同指标表达定位不同。根据表达量不同荧光亮度有强弱。

五、实验材料

 1.主要耗材

2.主要试剂

六、实验原理

用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交, 从而对组织细胞中的核酸进行定性、定位和相对定量分析。基本原理--碱基互补配对原理。

七、实验步骤

1、组织固定：组织取出洗净后立即放入固定液（DEPC水配制）中固定2-12h。

2、脱水：组织固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡，包埋。

3、切片：石蜡经切片机切片，摊片机捞片，62°烤箱烤片2h。

4、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ 15min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min，风干，DEPC水浸泡。

5、消化：根据组织固定时间长短，切片于修复液中煮沸10分钟，自然冷却。后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20min。纯水冲洗后PBS洗3次×5min。

6、阻断内源性过氧化物酶：滴加3%甲醇-H₂O₂，室温避光孵育15min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

7、预杂交：滴加预杂交液，37°C孵育1h。

8、杂交：倾去预杂交液，滴加含探针has-circ-ST6GALNAC6 probe 杂交液，浓度6ng/ul，恒温箱37度杂交过夜。

9、杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤。

10、滴加封闭液：滴加封闭血清（正常兔血清），室温30min。

11、滴加鼠抗地高辛标记过氧化物酶（anti-DIG-HRP）：倾去封闭液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育50min，后PBS洗3次×5min。

12、滴加FITC-TSA：滴加FITC-TSA试剂，避光室温反应5min。后TBST洗3次×10min，PBS洗1次×5min。

13、DAPI复染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min，冲洗后滴加抗荧光淬灭封片剂封片。

14.镜检拍照：切片于尼康正置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm,发蓝光；FAM(488)绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm，发红光。）