巨噬细胞流式检测方法

巨噬细胞是先天免疫系统的一种特殊的、长寿命的吞噬细胞。巨噬细胞是三种吞噬细胞类型之一，还有粒细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）和树突状细胞（DCs）。

一般来说，巨噬细胞可根据其功能和活化程度分为两个亚型：经典激活的M1巨噬细胞和交替激活的M2巨噬细胞；极化的这种性质表示频谱的相对两端，仅指在给定的时间和位置上的激活。已经发现了M1巨噬细胞具有与对细菌和细胞内病原体的免疫反应相关的促炎作用。另一方面，M2具有更多的抗炎作用，在血管生成和伤口愈合中具有相关功能。M2还与2型T辅助反应（Th2）有关，例如蠕虫免疫、哮喘和过敏。

M1型巨噬细胞表达MHC II、CD80、CD86和CD16/32，分泌TNF-α、IL-6和IL-12等促炎因子，以及CXCL9、CXCL10和CXCL11等趋化因子。另外，M2型巨噬细胞高表达arginase-1(Arg1)和CD206，分泌抗炎因子IL-10以及CCL2、CCL17和CCL22等趋化因子(如下图)。

腹腔中M1和M2型巨噬细胞流式染色实例

Mouse(腹腔贴壁细胞):M1和M2型巨噬细胞

1.标志物：

M1:F4/80+CD11b+CD86+cells；M2:F4/80+CD11b+CD206+cells；

2.流式细胞仪：Beckman Coulter，CytoFLEX；

3.流式抗体及用量：

PE anti-mouse CD86(1μg/test，105007，BioLegend)；APC anti-mouse CD206(0.5μg/test，141707，BioLegend)；PerCP-Cy5.5 anti-mouseCD11b(0.25μg/test，101227，BioLegend)；

AF488 anti-mouse F4/80(1μg/test，123119，BioLegend)；

4.染色条件：首先FcRblock孵育(1μg/test；101319；BioLegend)，4℃，5-10min；接着F4/80、CD11b、CD86表面染色，4℃，30min；

5.细胞固定：PBS洗涤细胞2~3次，加入细胞固定液（Fixation Buffer，500ul，420801，BioLegend）室温避光固定30min。

6.细胞膜通透：150g离心5min弃掉固定液，加入2ml用ddH2O 10倍稀释后的10×Intracellular Staining PermeabilizationWash Buffer（421002，BioLegend）重悬细胞，150g离心5min弃上清，重复步骤2~3次。

7.胞内染色：100μL1×Intracellular Staining PermeabilizationWash Buffer重悬细胞，加入CD206抗体（0.5μg/tests，141707，BioLegend），室温避光孵育30min。孵育完毕后，2ml1×Intracellular Staining PermeabilizationWash Buffer洗涤细胞2~3次，加入500μL cell staining buffer重悬细胞，上机。

8.分析软件：Flowjo(10.0.7)；

9.圈门策略及染色:(见下图)。