活性氧检测荧光法实验步骤

一、荧光法检测活性氧实验原理

活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit，也称ROS Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

二、荧光法检测活性氧实验步骤

1、细胞复苏

(1)将ddH₂O预温至37℃。

(2)戴上手套和口罩帽子，从液氮罐中取出装有目的细胞的冻存管（内有1 mL细胞混合液），立即投入37℃ddH₂O中，轻摇冻存管使之在1分钟内快速溶解。

(3)完全溶解后，75%酒精擦拭冻存管外壁消毒后带进超净台。

(4)在超净台中，在15 mL灭菌离心管中预先加入10 mL新鲜配制的培养基，打开冻存管，将所有冻融的细胞悬液加入该离心管中，常温1000 rpm离心3分钟，吸除上层的培养液。

(5)1mL培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀后加入T25细胞培养瓶中，补足培养基至5 mL，置于37℃、5%CO₂培养箱培养。

(6)48小时后换液，细胞融合接近80%时即可传代。

2、细胞培养

根据待测细胞的种类，选择合适的培养基培养，操作过程保持无菌。

3、活性氧检测

(1)按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10μM；

(2)去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA；

(3)37度培养箱中孵育15-20 min，用无血清培养液洗涤细胞3次；

(4)置于显微镜下观察拍照。

4、活性氧检测注意事项

(1)试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

(2)实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封(低温干燥)保存。

(3)标准品稀释液即可视为阴性对照或者空白:预处理后的样本无需稀释。

(4)严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

(5)所有液体组分使用前充分摇匀。

(6)活性氧检测必须使用活细胞。