DNA pulldown实验操作步骤

1．探针设计及标记

①采用基因组DNA做模板，经PCR扩增启动子片段；

②将其克隆至pMD-18T克隆载体，并测序鉴定成功；

③使用PCR法或末端标记法标记探针；

④标记的探针利用凝胶回收试剂盒纯化回收探针，并检测探针浓度；

⑤-20℃保存，待用；

2．Pull down

①预先混合5µg生物素标记的DNA和500µg核蛋白，置于冰上；

②取100μL Streptavidin-agaroseG串珠，用冰冷PBS洗一次，5000 g离心30秒；

③将DNA与蛋白的混合物加到串珠中，重悬珠子；

④4℃孵育1小时；

⑤5000g，离心30秒，去除上清，收集沉淀；

⑥用冰冷PBS洗串珠三次，5000 g离心1分钟，尽可能去除上清，收集沉淀；

⑦加入30μL蛋白上样缓冲液，重悬沉淀，沸水煮10分钟，

3．蛋白质检测--Western Blot

①电泳：实验采用不连续系统蛋白质SDS-PAGE，浓度为5%浓缩胶和8~12%浓度分离胶；每孔上样40~60 ug总蛋白，开始电压为100 v,到达分离胶后调为120 v；

②转膜：转膜为恒流转膜，电流为200 mA，时间根据目的蛋白分子量选择60~120 min。

③封闭：蛋白膜放置到TBST溶液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液；加入5%脱脂奶粉封闭液，室温50rpm，封闭60分钟。

④孵育一抗：根据蛋白Marker指示将PVDF膜剪开，参考一抗浓度；将PVDF膜分别放入含各自一抗溶液中，4度孵育一抗过夜，然后放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15 min。

⑤孵育二抗：参考二抗浓度，按比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。将PVDF膜加入稀释好的二抗，室温摇动孵育1h；放入TBST洗涤液，摇动洗涤3次，每次15 min。

⑥显色：使用化学发光试剂，黑暗处显色，用X光片压片，显影液及定影液洗片。

4．蛋白质检测--MS

①切胶：用刀片切取胶粒（胶粒直径1-2 mm），置于1.5mL EP管中。

②清洗：用200 uL MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟。

③脱色：对于考染胶，加考染胶色液（25mM NH4HCO3，50%ACN）200uL，37℃20分钟或超声脱色5分钟，吸干，重复脱色2-3次，至蓝色褪去。

④脱水：加ACN 100μL脱水至胶粒变白，吸弃ACN。

⑤清洗：用200μL MilliQ震荡清洗2次，每次10分钟；然后用200uL 50%ACN震荡清洗2次，每次10分钟。

⑥脱水：加ACN 100μL脱水至胶粒变白，吸弃ACN。

⑦用25 mM NH4HCO3稀释Trypsin至12.5 mg/ml，每管加10μL，稍微离心一下，让酶液与胶粒充分接触，4℃放置30 min，待酶液被胶粒完全吸收，吸弃多余的酶液，加25 mM NH4HCO3 20uL，37℃过夜(16h)。

⑧质谱样品使用德国Bruker公司的Ultraflex III质谱仪开展分析，参数设置：反射模式；

⑨离子源加速电压1为24kv；

⑩加速电压2为22kv；

11离子延迟提取0.000ns；

12真空度1.4×10-7 Torr；

13质谱信号单次扫描累加200次；

14使用标准Maker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，测定范围控制在700-4000；

15样品的肽质量指纹图谱，胰酶自降解峰和污染物质的峰自动剔除；

16利用LIFT软件将PMF强度最大的5个峰进行串级质谱分析（峰强度大于300）。