DNA pull-dwon实验介绍

一、实验流程

一般来说，该实验首先，需要针对待研究目的基因的调控区域设计并制备特异性探针（以脱硫生物素标记为主流）；同时，制备细胞核提取物；将探针和核提取物共同孵育，DNA结合蛋白就会和靶向序列特异性结合；然后，通过亲和素磁珠纯化蛋白质DNA复合物；最后针对获得的蛋白，使用Western blot验证或者质谱方式鉴定蛋白质类型。

二、DNA pull-down技术应用

DNA pull-down以感兴趣的DNA序列为探针，寻找与该序列结合的蛋白质，最常见的应用是寻找某特定基因启动子区域的转录因子。

a.DNA Pull down WB，用于检测目标DNA序列与某样本中的待测蛋白是否存在相互作用；

b.DNA Pull down MS，用于筛选目标DNA序列与某样本中的哪些蛋白具有相互作用。

三、RNA pulldown优缺点：

①富集分析低丰度蛋白；

②探针制备简便，周期短；

③获得特异性蛋白与下游蛋白质检测技术兼容；

缺点：

①长连探针往往存在非特异结合现象；

②反应条件要求无核酸酶；

③体外实验，相对体内实验存在一定弊端；

四、RNA pulldown实验步骤

1.探针设计及标记

2.样本前处理

3.Pull down

4.蛋白质检测--Western blot

5.蛋白质检测--MS