RNA pull-down详细实验步骤

1、磁珠准备

（1）取3µg Biotin标记的RNA，加入适量Structure Buffer，使得RNA形成二级结构。然后将RNA 95℃加热2 min，冰浴3 min，室温静置30 min；

（2）磁珠准备：使用RIP Lysis 500µL冲洗磁珠3次，用50µLRIP Lysis Buffer重悬磁珠；

（3）将磁珠加入到第（1）步的RNA中，室温孵育1h；

（4）将磁珠与RNA的混合物去上清；

（5）RIP Lysis Buffer冲洗3次，切记将液体沿壁加入或滴加，上下缓慢翻转混匀。

2、RNA Pull down（提取总蛋白做）

（1）用500 uL RIP Lysis Buffer（使用时加入RNase抑制剂与蛋白酶抑制剂）裂解细胞，并用细胞破碎器破碎细胞，冰上裂解15 min，4℃12000 rpm离心20 min，弃沉淀，保留上清；

（2）往2.1制备的磁珠-RNA混合物中加入上述上清液，室温孵育2 h；

（3）将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物弃上清，使用RIP Lysis Buffer冲洗5次，1次1 mL；

（4）向磁珠中加入生物素洗脱液，室温、混匀仪上洗脱15 min；

（5）放入磁性分离器中，将液体转移到新的EP管中，该液体即为洗脱产物；

（6）取部分洗脱产物于混合物中加2×SDS上样缓冲液，95℃变性10 min，跑SDS-PAGE凝胶；剩下的产物可用于质谱。

3、SDS-PAGE与染色

配制好胶，将准备好样品上样，恒流，16mA/胶，直至溴酚蓝跑至胶底部，完成电泳。电泳结束后，用硝酸银染色

（1）固定：30 min（乙醇：乙酸：水=4：1：5体积比）；

（2）敏化：30 min（乙酸钠10.2 g，硫代硫酸钠0.471 g，乙醇45 mL，加水至150 mL）；

（3）水洗4次，每次10 min；

（4）银染：30 min（硝酸银0.375 g，加水至15 mL）；

（5）水洗2次每次40s；

（6）显色：显影至条带清楚（碳酸钠4.5g，72 uL甲醛，加水至180 mL）；

（7）终止：5 min（Na2EDTA 2.19g，加水至150 mL）。