​RNA pull-down注意事项与常见问题

一、RNA pull-down实验注意事项

1、实验前期准备

（1）首先是样本的收集和处理，如果样本是细胞，要考虑细胞中该RNA的表达量，如果RNA含量较低，那提取出来的RBP可想而知会非常少，建议大家提前准备较多的细胞。（本人的试剂盒要求的量是107个细胞，实验操作时使用了8个10 cm大皿。）也看到很多小伙伴说可以先进行过表达该RNA后再进行pull-down实验，大家可以尝试。

（2）由于该实验我们提取的目的蛋白和细胞中的RNA含量都较低，因此更需要注意的是：实验操作过程预防RNA和蛋白的降解！进行实验的前两天，一定要准备好实验需要的枪头，EP管等。均需无酶无菌！提前高压，做好准备，实验进行时，戴好手套和口罩！实验操作台提前使用DEPC水擦拭！剩余耗材准备：磁力架，碎冰，低温高速离心机，冰盒，漩涡振荡器。

2、实验操作重点

实验的操作，一般要注意以下几个关键步骤。

（1）探针的制备：这步强烈建议大家交给靠谱的公司进行构建，便宜好用易上手！

（2）探针-磁珠制备：按照说明书进行操作，没有任何问题。

（3）蛋白样本的提取，除核酸：即制备蛋白样本。如果设计的组较多，可以选择分别提取，每次提取的蛋白样本可短时间内，冻存于-80度冰箱低温保存。

（4）RNA pull-down：同样是按照说明书进行。重点：到最后一步孵育洗脱后收集上清（即最终样本），大家可以根据自己的情况，加适当量buffer（减少量）！例如本人试剂盒上写60μL，但加上60μL后，蛋白浓度太低，以至于后续实验进行有些困难。

二、RNA pull-down实验常见问题与处理方法

问题1：RNA降解

可能原因：

1）无核酸酶的环境被破坏

2）体外转录的RNA探针降解

解决方法：

1）清洗和使用新开的离心管和试剂等

2）RNA探针合成后，电泳检测其长度和浓度

问题2：RNA结合蛋白的亲和力不够：

可能原因：

1）结合缓冲环境没有优化

2）裂解不完全

3）磁珠用量不足

4）RNA探针用量不足

解决方法：

1）优化孵育时间、温度、盐浓度等条件

2）增加裂解液和蛋白上样量的比例

3）增加裂解液

4）增加磁珠用量

5）增加探针用量

6）确定生物素和链霉亲和素效率

问题3：RNA结合蛋白没有结合

可能原因：

1）靶蛋白量不足

2）缓冲体系不对

3）RNA探针和蛋白的亲和力本来就低

解决方法：

1）增加上样蛋白量

2）应用低盐体系

3）加入交联试剂

问题4：结合的非特异性高

可能原因：

1）缓冲环境没有优化

2）缓冲环境严谨性低

3）样品没有裂解完全和裂解体系没有优化

解决方法：

1）优化孵育时间温度盐浓度等条件

2）使用严谨性高的缓冲体系

3）调低RNA探针和样品的比例

4）提高裂解液的量