细胞冻存与复苏问题汇总大全

问题一：细胞冻存为什么要添加保护剂?

细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术，细胞在不加任何保护剂的情况下冷冻，细胞内外的水分会很快形成水晶从而引发一系列的不良反应：首先，部分蛋白质因局部电解质浓度增高和pH值改变而变性，导致细胞内部空间结构发生改变。

其次，细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质，酶的变性等会限碍细胞的能量代谢。再次，胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变，使细胞内容物丧失。

最后，随着冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间结构发生损伤从而引起细胞死亡。

添加冷冻保护剂可以很好的改善细胞的破坏与死亡情况。

问题二：冷冻管应如何解冻?

从液氮押中取出细胞置-80℃冰箱中数分钟，让管中液氮控发后，再放入37℃的水

浴锅中(预防冻存管爆裂)，轻摇冻存管使其最好在2 min内全部融化，并注意水面不可超过冻存管管口，否则容易造成污染。

问题三：高效进行细胞冻存应该注意什么?

1、缓慢冷冻：慢冻可使细胞逐步脱水，细胞不会因产生大的冰晶而受到损害。相反，细胞内若出现大结晶会引起细胞膜、细胞器的损伤和破裂。

2、细胞活力及浓度：细胞应在生长良好、致密度约为80-90%活力达90%以上的状态下冻存。细胞活力差的细胞在冻存后的成活率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存。

3、冻存密度：冻存时细胞密度少于5x105个活细胞/mL时，很难成功复苏。

4、冻存管盖子：冻存管的盖子一定要拧紧，否则水浴复苏时水会渗入造成污染。

5、冻存时间：细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。我们建议在-80℃冰箱中的保存时间不要超过48h。

问题四：细胞冻存和复苏的最佳时间是什么时候?

细胞在体外生长期间，通常分为三个阶段:潜伏期、指数生长期和平台期。潜伏期通常是细胞刚刚传代，此时细胞开始贴附基质和伸展骨架，代谢活动集中在粘附蛋白和骨架蛋白的表达，细胞量在这段时间内几乎没有增加。

随后，细胞开始指数生长期，核酸转录翻译旺盛，DNA解旋、配对频繁，胞内物质传递迅速，细胞数量迅速增长。如果在这个时期冻存，实际上是强行将细胞冻结在代谢的某一时刻，势必造成对解旋的DNA、转录翻译中的RNA和蛋白的机械损伤，增加某个环节发生错误的风险。

有着细胞数量的增长，培养容器内，细胞汇合达到90%以上。大部分细胞因为“接触抑制”而停止高速代谢和增殖，胞内活动趋于平缓。所以，我们建议在刚刚进入平台期时冻存细胞，既可以获得足量的细胞，也不会对细胞造成过多的机械损伤。

问题五：临床手术切下来的肿瘤组织的冻存和复苏应该怎么做?

不论是肿瘤组织、正常组织或细胞的冻存和复苏需要把握的关键都是“慢冻快融”。

组织冻存中使用的“玻璃化液”和细胞冻存中使用的“冻存液”作用的本质都是结合或吸收细胞内的自由水，避免或减少细胞在冷冻过程中，胞内的自由水凝结为冰晶刺破细胞。

通常，环境温度在-5~-10℃之间时，细胞内开始形成冰晶。快速的冷冻会加剧冰晶的形成，所以，我们在冻存细胞时会使用程序降温仪，含异内醇的程序降温盒或者特质的泡沫盒。这些仪器、设备、试剂的使用都是为了减缓细胞冷冻速度。

至于复苏，我们一般是在37℃水浴锅中震荡，让细胞、组织迅速度过“冰晶危险期”。

问题五：细胞在液氮中可以保存多久?

细胞冻存可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。

为妥善起见，特别是很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏1次，观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最好也每年复苏1次后，再继续冻存。