细胞冷冻与复苏操作注意事项

一、细胞冻存注意事项

1、DMSO配制的时候会放热，一定要等冻存液冷却后使用，避免灼伤细胞；

2、细胞离心后尽量吸干净上清液，减少培养基残留，避免稀释冻存液；

3、不建议手动梯度降温，温度不稳定，容易降低存活率；

4、注意程序降温盒内异丙醇的量必须高于最低刻度线；冻存5次后异丙醇需要更换一次，以免影响冻存效果；程序降温盒需恢复到室温以后才能继续使用，不能从冰箱拿出来直接使用；

5、细胞悬液加入冻存液以后尽量短时间的在常温放置，DMSO常温下对细胞损伤大，分装完成后立即转入程序降温盒放到-80度冰箱，不需要放4度；

6、-80度冻存过夜后可以转入液氮长期保存，转入液氮的过程需要对冻存盒进行保冷，不要长时间在常温暴露，避免冻存管融化；

7、若没有液氮罐，存放在-80度的时候一定要放靠里面的位置，避免开关冰箱导致温度不稳定。

8、细胞冻存后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存，为稳妥起见可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况，再继续冻存；

9、由于没有使用冻存盒，在转入液氮的过程中一定要对冻存管做好保冷措施，不能直接用手拿，可以用干冰或者少量液氮保护后转移，操作过程注意安全；

10、转移过程要快，避免冻存管暴露于常温后融化；

11、若没有液氮罐，存放在-80度冰箱的时候一定要放靠里面的位置，避免开关冰箱导致温度不稳定；

二、细胞复苏注意事项

1、水浴锅的位置如果与液氮罐不是一个房间，需要对冻存管进行保冷后转移到水浴锅旁，避免路途细胞表面融化；

2、细胞溶解过程快速摇晃以加速溶解；

3、已溶解的冻存细胞尽量短时间的在常温存放，尽快离心去除DMSO；

4、贴壁细胞复苏24小时后观察，若密度达到80%，则正常传代；若密度不到80%则继续培养到48小时再换液；

5、悬浮细胞复苏3天内不建议离心换液；

6、对DMSO不敏感的细胞在复苏时也可不离心，减少操作步骤，也可降低污染的几率。将解冻的细胞悬液直接转移至T25细胞瓶内，补加新鲜培养基，放入温箱内培养。但培养12~24h后必须换新鲜的培养基，移除死细胞。