细胞培养实常见问题及处理汇总

一、培养液出现沉淀，但pH值不变

解决方法：

1、用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来，冰冻保存培养液；

2、用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌；

3、将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液；

二、培养液出现沉淀，同时pH发生变化原因：细菌或真菌污染；

解决方法：丢弃培养物，或用抗生素除菌；

三、培养细胞不贴壁原因：

1、胰蛋白酶消化过度；

2、支原体污染；

3、培养液中无贴壁因子；

解决方法：

1、缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度；

2、分离培养物，检测支原体，清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培物；

四、悬浮细胞成簇

原因：1、培养液中含钙、镁离子；

2、支原体污染；

3、蛋白酶过度消化使得细胞裂解释放DNA；解决方法:

1、用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液；

2、分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物；

3、用DNase1处理细胞；

五、培养细胞死亡

原因：

1、培养箱内无CO2；

2、培养箱内温度波动太大；

3、细胞冻存或复苏过程中损伤；

4、培养液渗透压不正确；

5、培养液中有毒代谢产物堆积；

解决方法：

1、检测培养箱内CO2；

2、检查培养箱内温度；

3、取新的保存细胞种；

4、检测培养液渗透压，注意:大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260-350mOsm/kg；

5、加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压；

6、换入新鲜培养液；

六、培养细胞生长减慢

原因：

1、由于更换不同培养液或血清；

2、培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏；

3、培养物中有少量细菌或真菌污染；

4、试剂保存不当；

5、细胞起始浓度太低；

6、细胞已老化；

7、支原体污染；

解决方法：

1、比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验；

2、增加起始培养细胞浓度；

3、让细胞逐渐适应新培养液；

4、换入新鲜配制培养液；

5、补加谷氨酰胺或生长因子；

6、用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌；

7、血清需保存在-5℃到-20℃。培养液需在2-8℃避光保存。含血清完全培养液在2-8℃保存，并在2周内用完；

8、增加接种细胞起始浓度；

9、换用新的保种细胞；

10、分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物；