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细胞技术

细胞冻存与复苏的操作步骤

2025-02-10 细胞技术 加入收藏
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一,利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一,利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种,起到了细胞保种的作用。除此之外,还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。那现在我们来看看细胞冻存与复苏的操作步骤:

一、细胞冻存的详细操作步骤

1.配制含10%DMSO或甘油、1020%小牛血清的冻存培养液;

2.取对数生长期的细胞,去除旧培养液,用PBS清洗。

3.去除PBS,加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来;

4.离心1000rpm5min

5.去除胰蛋白酶,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml1×107/ml

6.将细胞分装入冻存管中,每管11.5 ml

7.在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者;

8.冻存:标准的冻存程序为降温速率-1-2℃/min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。

二、细胞复苏的详细操作步骤

1.提前打开水浴锅,将水温调至37℃,将需要用到的培养基放入水浴锅预热。

2.复苏时,将冻存细胞放入水浴锅中快速摇晃使细胞在1~2min内迅速解冻。

3.准备一只15ml离心管,加入5ml培养基,将解冻后的细胞悬液吸出放入到离心管内混匀,

盖上盖子,放入离心机内,1000rpm离心5min

4.离心完毕,用移液枪小心吸去上清,加入1mL培养基重悬细胞。

5.将细胞悬液转移至培养皿或培养瓶中,补充适量培养基,将细胞吹打均匀,置于37℃5%CO2培养箱培养。

6.这样我们就完成了细胞的复苏的流程,复苏后的细胞通常在24小时内会贴壁,第二天我们取出细胞便可以在显微镜下观察细胞的状态。

三、细胞冻存与复苏操作的注意事项

1.取细胞的过程中注意带好防冻手套,护目镜。此项尤为重要,细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸。

2.冻存液:冻存液的配置已是常识,在这里不作详述,但二甲基亚砜(DMSO)对细胞不是完全无毒副作用,在常温下,二甲基亚砜对细胞的毒副作较大,因此,必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢,会造成细胞的损伤。

3.离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高,注意加入少量培养液可稀释其浓度,以减少对细胞的损伤。

4.细胞贴壁少:教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml15m培养液,而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。

6.复苏细胞分装:复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中,分装过多,细胞浓度过低,不利于细胞的贴壁。

7.加培养基的量:加培养基的量主要和DMSO的浓度相关,如果加培养基的太少,DMSO的浓度就会比较大,会影响细胞生长。从文献资料上看,DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有影响。还有一个说法是1%,所以如果冻存液的浓度是10DMSO,那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。


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