荧光定量PCR实验操作步骤

荧光定量PCR第一步：RNA提取

1、首先进行不同样本的预处理：

（1）组织样本：迅速将新鲜的组织切成合适的大小，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解，或直接加入裂解液后用匀浆器匀浆。每30-50mg组织加1ml Trizol。

（2）全血样品：加入3-5倍体积的红细胞裂解液到血样中，室温孵育10min，室温3500rpm离心6min。弃上清，原每2-3ml全血样品加1mL Trizol。

（3）细胞样品：悬浮液中生长的细胞，通过离心收集细胞后，每1×105〜106细胞加入1mL Trizol，移液器吹打混匀，直接裂解或-80℃储存一个月。贴壁生长的细胞，可以移除培养基后，将1mL Trizol直接加入直径3.5cm的培养皿中裂解细胞。

2、直接法提取RNA

（1）加入1ml Trizol试剂，混匀，冰上孵育10min。

（2）4℃，12000rpm离心10min，小心转移上清液到不含颗粒的新EP管中。

（3）加入200ul氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育5min。

（4）4℃，12000rpm离心15min。混合液分三层，包括最下面的苯酚-氯仿有机相，中间相和上层水相。小心转移上层水相到新的EP管（大约60％体积的Trizol），不要吸取中间相，可留下少量上层液体！（Note：质量比数量更重要！）

（5）加入等体积的异丙醇，轻轻地颠倒混匀约10次，室温放置10min。

（6）4℃，12000rpm离心10min。弃上清，1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀两次。

（7）4℃，12000rpm离心5min，弃上清，室温下风干5-10min（不要太干，过度干燥会导致RNA难溶解！）。将RNA溶于15μl-50μlDEPC水中。

（8）立即进行反转录反应，或先-80℃长期保存。

荧光定量PCR第二步：反转录

1、RNA纯度和完整度鉴定

紫外分光光度法测定RNA浓度和纯度：在pH8.0的TE缓冲液中稀释RNA，并在260nm和280nm下测量吸光度，一般Abs 260nm：280nm比率应该是1.7-2.1，说明RNA的纯度较好。

RNA条带完整度测定：评估RNA的完整性，取部分样本做琼脂糖凝胶电泳。完整的RNA条带包括28S，18S和5S核糖体RNA。通常，28S/18S>2意味着RNA具有较高的完整度。

2、反转录：PCR条件：42℃孵育40min，85℃加热5min，4℃保存。将第一链cDNA储存在-20℃。

荧光定量PCR第三步：引物设计

引物设计标准

（1）PCR扩增子长度：50-180bp；

（2）引物长度17-25bp；

（3）GC含量：45-55％；

（4）Tm：58〜68℃，引物对间差异不大于2℃；

（5）碱基要随机分布，尽量均匀。3′端要避开AT，GC rich的区域，避开T/C或A/G连续结构（2-3个）。引物自身和引物间不能存在互补。引物3’末端为G或C；

（6）避免DNA污染，跨外显子接头区；

（7）至少设计2-3对引物，预实验筛选最佳引物；

（8）将所有设计的引物在NCBI数据库中比对以确定它们对靶基因特异性。

荧光定量PCR第四步：Q-PCR反应

注意：一般使用cDNA模板的10倍稀释液加入反应体系，因为过高浓度的反转录体系残留如逆转录酶和相关缓冲液组分会抑制DNA聚合酶活性，从而降低扩增效率。

1、扩增循环。

2、溶解程序：扩增循环结束后，降温至60℃，然后加热升温至95℃变性DNA产物。

变性：高温孵育将dsDNA变成成单链，并松弛ssDNA中的二级结构。通常DNA聚合酶可承受的最高温度为95℃。如果模板GC含量高，可适当延长变性时间。

退火：退火期间，互补序列结合，一般使用低于引物的Tm 5℃作最适退火温度。

延伸：70-72℃，DNA聚合酶活性最佳，并且以每秒100个碱基的速率延伸。当qPCR中的产物长度较小时，此步骤可与退火在60℃同步进行。