细胞培养用血清中的纳米细菌和黑胶虫有关系么？

引言

芬兰科学家Ciftcioglu et al进行哺乳动物细胞培养时发现细胞内存在一种原核微生物，能通过100 nm的滤菌器，Kajander将其命名为纳米细菌(nanobacteria)。纳米细菌广泛存在于自然界的矿物质中和生物体内，能感染人类、牛、鹿和其它哺乳动物，是一种人畜共患的致病原。纳米细菌能感染人体任何组织和细胞，分泌钙化的脂多糖生物膜，具有较大的毒性。能引起受感染细胞发生空泡样改变，与人类多种疾病的发生密切相关。纳米细菌的发现及其生物学特性的揭示，引起了众多国内外学者的关注。

1 纳米细菌的发现

芬兰科学家Ciftcioglu et al在其细胞培养过程中，发现在胎牛血清中存在一种直径50-500 nm的微粒；这种颗粒物对伽玛射线具有很强的耐受性，针对包括支原体在内的所有已知微生物的特异性检测实验均为阴性，这种颗粒物在血琼脂培养基以及支原体培养基中无法生长，通常的细菌染色方法难以着色。

因此，Kajander判定这是一种新的微生物，根据其体型微小并且栖息在血液中的特点，将其命名为Nanobacterium sanguineum，简称Nanobacteria。中文译名纳米细菌，并将菌种保存于德国微生物存储中心 (DSM No: 5819-5821, the GermanCollection of Micro-organisms, Braunschweig, Germany)。

2 纳米细菌的生物学特性

2.1 纳米细菌——哺乳动物体内最小的细菌

细胞培养时所使用的血清通常采用过滤法达到无菌的目的，通常采用直径0.1 μm的滤膜过滤除菌，Kajander研究发现，0.1 μm的滤膜过滤并不能有效地清除血清中的纳米细菌，但是血清经过0.05 μm的滤膜过滤则能有效清除纳米细菌污染，细胞培养条件下的纳米细菌经过0.2 μm的滤膜过滤后约有3%的纳米细菌可以通过滤膜，而在加压过滤的情况下，约有50%的纳米细菌可以通过0.2 μm的滤膜。

刚刚经过过滤的纳米细菌在相差显微镜下无法发现。但在不含血清添加剂的细胞培养液中培养24 h后, 即可以用相差显微镜观测到。电子显微镜观察显示，纳米细菌的平均直径为200 nm，而子代纳米细菌的最小直径仅50 nm。传统的观点认为，只有当细胞直径在不低于140 nm时，才能维持其最基本的新陈代谢。

Kajander认为，纳米细菌可能是地球形成早期、在原始大气条件下的一种最原始的生命形式，因此不能用衡量已经经过几十亿年进化的生命形式的观点去衡量这种古老的生命形式，并且推测, 纳米细菌遭受不良因素的侵害后可以形成许多的体形微小的碎片，并将其释放到环境中。每一个碎片都可能携带部分遗传信息，在特定条件下，这些“基本”颗粒聚集在一起形成群落，当足够数量的“基本”颗粒提供完整的遗传信息时，则可以形成新的纳米细菌。

2.2 纳米细菌缓慢的增殖周期

微生物学家通常是通过对某种微生物进行培养，进而了解该种微生物的特性。然而，并非每种微生物都是可以在实验室中进行培养的，主要原因在于这些微生物的培养条件我们并不清楚，其生存环境以及是否与其他微生物存在共生关系我们并不十分了解。纳米细菌就是一种对生长环境要求非常苛刻的微生物，其新陈代谢率极为缓慢，仅为普通细菌的1/10 000。

研究发现，纳米细菌主要利用环境中的氨基酸而不是葡萄糖来提供能量，谷氨酰胺、天冬酰胺以及精氨酸均可被其利用。在37 ℃有50-10 mL/L的二氧化碳及900-950 mL/L的空气存在的潮湿环境下，并且在含有100 mL/L胎牛血清和适量谷氨酰胺的pH值7.4的细胞培养基中，纳米细菌能够缓慢生长，平均倍增时间为3 d；

而在无血清的细胞培养基中，其增殖速度变慢，细菌倍增时间可延长至5-6 d；在添加适量促纳米细菌生长因子BGF（一种杆菌培养上清的超滤液）或N3（纳米细菌培养上清的超滤液）的条件下，其增殖速度加快, 倍增时间可缩短至0.6-1 d。在有促纳米细菌生长因子BGF存在的条件下，纳米细菌甚至可以在固体培养基中生长，并形成直径l mm大小的细菌集落。

2.3 纳米细菌独特的生物矿化现象

当在含血清的培养基中培养的纳米细菌被转移至不含血清的培养基中继续培养时 (DMEM或RPMI-1640)，在1 a之内就可以观察到纳米细菌出现贴壁现象，在1 wk之内，就可以在纳米细菌的周围形成几微米厚的生物被膜 (biofilm)，并且紧紧贴附于培养瓶底部，而纳米细菌栖息其中（这与在含血清培养基中培养的纳米细菌的形态明显不同），此时其大小接近于一个酵母细胞。2-3 wk以后，由于生物被膜的增厚，其直径已近似于一个红细胞的大小。

用EDX法对这种生物被膜的化学组成进行分析，显示其钙磷的峰值与羟基磷灰石极其相似，电子显微镜观察以及傅立叶转换红外频谱（fourier transform IR spectroscopy， FTIR）分析显示其主要成分为碳酸羟基磷灰石(carbonate hydroxyapatite)，而且，不论在有无血清作为添加剂的情况下，都可以见到这种被羟基磷灰石包绕的纳米细菌，这种情况甚至可以在处于分裂期的纳米细菌中见到。

纳米细菌并不产生尿激酶和碱性磷酸酶，并且即便经过长达数周的培养，其培养基的pH值也不会出现明显的变化，一直稳定在7.4左右，这表明在纳米细菌细胞膜表面所生成的羟基磷灰石结晶是源自于生物大分子的，即生物矿化现象。

而并非是由于pH值改变所导致的简单的物理结晶现象。纳米细菌利用培养体系中的钙、磷合成羟基磷灰石作为其生物被膜的主要成分, 这种生物矿化过程受到生长环境中某些因素的调控，从而使其呈现不同的外观，如羟基磷灰石形、细菌被膜形、沙粒形、结石形和类似肿瘤的外形。

在含有新鲜血清的培养基中纳米细菌的生物矿化现象程度较轻微，这是由于血清中含有强效羟基磷灰石合成抑制因子， 骨钙素(osteocalcin) 和胎球蛋白(fetuin)，由于这些抑制蛋白的存在，所以在有血清存在的情况下，纳米细菌的生物矿化作用受到明显抑制。

当血清浓度降低时，纳米细菌的生物矿化现象增强，在不含血清的培养体系中，生物矿化现象剧烈而迅速。尽管改良的Loeffler固体培养基中含有750 mL/L血清成分，但血清蛋白成分在灭菌过程中受到破坏，所以在此培养基中的纳米细菌的矿化作用并不受抑制， 在此培养基中生长的纳米细菌其菌落直径可达1-5 mm。

另外，当有乙二胺四乙酸(EDTA)存在时，纳米细菌的生物现象会受到明显的抑制。由于矿化生物被膜的保护作用以及极其缓慢的新陈代谢率，使纳米细菌能够耐受各种不利的物理条件和化学损伤因素以及多种抗生素的攻击。

2.4 纳米细菌的检测方法

由于纳米细菌在标准微生物培养基中无法生长，并且即便是在最适宜其生长的细胞培养环境中，纳米细菌的生长也极为缓慢，其新陈代谢率仅为普通细菌的万分之一，这使得许多基于检测细菌新陈代谢的微生物学方法无法检测纳米细菌的存在，由于纳米细菌难以用传统的火焰法和乙醇法固定，并且大多数染料无法穿透其细胞壁，而且不能用普通显微镜对其进行观察，因此常规的细菌学染色法并不能检测到纳米细菌的存在。

通过Kajander et al的研究，发现70℃干烤10 min，可以将其有效固定；另外，用茜素红S、刚果红以及硝酸银染料可以使纳米细菌着色；而培养状态下的纳米细菌可以在放大400倍的相差显微镜下清晰地观察其生长情况；用DNA荧光染料 (Dapi或Hoechst) 按普通细菌DNA染色的条件对纳米细菌DNA进行染色均不成功，而当按照线粒体DNA以及病毒DNA染色条件。

对纳米细菌DNA进行染色时，荧光显微镜下可以观察到特征性的荧光；用纳米细菌特异性抗体进行荧光染色也可以清晰地显示纳米细菌的存在；利用电子显微镜对经过负染的纳米细菌进行观察，可以清晰的显示80-350 nm大小、单独或聚集成簇的纳米细菌以及其表面的生物被膜（biofilm）结构；而用透射电镜对纳米细菌的超薄切片进行观察，可以清晰的显示其内部结构。

2.5 纳米细菌的核酸

因为蛋白酶K、蛋白激酶、脂肪酶、淀粉酶以及超声波不能有效地破坏、裂解纳米细菌，所以不能采用标准的核酸抽提法抽提纳米细菌的核酸.Kajander et al 用HCl对纳米细菌进行消化：室温时, 将纳米细菌置于1 mol/L的HCl中数分钟后, 其羟基磷灰石外壳便会消失, 随后, 纳米细菌的蛋白和核酸成分逐渐被释放到裂解液中。用HCl裂解法从纳米细菌中抽提的"核酸"成分的最大紫外吸收峰在270 nm处，而按常规方法抽提的普通细菌的核酸的最大紫外吸收峰在260 nm处。

由于用盐酸裂解法抽提的“核酸”产物在pH值高于2-3时发生凝聚现象，所以未能对其进行进一步分析.经过实验，发现除用1 mol/L的HCl消化外，EDTASDS溶液二次煮沸消化、EDTA-EGTA-枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)消化、液氮研磨法以及木瓜蛋白酶—SDS消化， 均能达到消化纳米细菌的目的。

用后面几种方法消化纳米细菌后都可以获得白色纤维素样的抽提物，虽然这种物质在其抽提过程中表现出与DNA相似的沉淀、溶解特征, 然而并不能被EB(溴苯乙啶)染色，而针对胞嘧啶及其修饰物的特异性探针检测均呈现非特异性结合，从而显示其并非核酸成分。紫外光谱研究显示， 这种假想的"核酸"与HCl裂解纳米细菌所得“核酸”具有相似的紫外吸收峰，其最大紫外吸收峰在269-270 nm，这与核酸中胸腺嘧啶 (T, 269-270nm) 和胞嘧啶 (C, 271-275 nm) 含量高而腺嘌呤、鸟嘌呤 (A、G, 250-260 nm) 含量低的情况相吻合.

而高效液相色谱(HPLC)分析显示, 这种假想的"核酸"不能被蚁酸水解成单个的核苷酸。而在3 mol/L或5 mol/L的HCl中煮沸5 h。再经葡聚糖凝胶G-50柱层析后，HPLC分析其水解产物表现出比较纯的核苷酸 (nucleobase) 的峰值，其中两个峰值与methyldeoxyadenosine(甲基脱氧嘧啶)和7-deazaadenosine特征性的峰值相同。