免疫组化（IHC）染色常见问题及其解决方法 上

免疫组化问题一：无信号-阴性结果

1、真阴性结果：组织或细胞不表达抗原，无法检测到相应信号;或抗原表达量太低，无法检测到相关信号。

2、假阴性结果

（1）染色前错误：切片时选错蜡块或拿错切片，这种情况可用H&E染色验证。

（2）染色操作错误：

①确认是否忽略了应加的某种试剂，包括抗抗、底物等。

②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否在足够的温度条件下满足足够的时间。

③复查抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗四配。

④检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体。

⑤检查抗体稀释比及所使用的抗体稀释液是否合适。

⑥确定组织或细胞标本的储存条件。

⑦检查底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些

底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。

⑧检查冲洗液是否和反应试剂匹配，冲洗液的pH值也很重要，与过氧化物酶底物适配的溶液中不应含有叠氮钠。

⑨检查复染、脱水、透明和封片剂是否和所使用的色原匹配。荧光素染色封片要选用水溶性封片剂，AEAPRed/FastRed和其它水溶性染料不能用二甲苯有机溶剂透明。

问题二：信号弱一弱阳性结果

如果阴性对照没有染色而阳性对照标本阳性强度较弱，除了考虑上述因素外，还应考虑：

1、标本的固定方式：固定剂不适当，固定时间过长或过短，固定温度过高，都会影响到所检测的抗原数量和质量。

2、抗原修复方式不当：由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，大部分抗体在做免疫组化时需用抗原热修复或酶消化等方法使抗原暴露，至于使用哪一种方法，应参照试剂生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。同时亦须注意，小部分抗体在进行免疫组化实验时是不需要进行抗原修复操作的，如果进行了抗原修复操作反而可能会使阳性着色减弱。

3、第一抗体效价太低或被过度稀释，或者孵音的温度/时间不合适也可导致弱阳性结果。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。

4、切片上如遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。

5、孵育时切片是否水平放置，否则会导致抗体流失。