免疫组化/IHC实验操作步骤

一、免疫组化实验器材准备

生化培养箱、微波炉、生物组织摊烤机、冰箱、显微镜、盖玻片、载玻片、无水乙醇、双氧水、中性树胶、二甲苯、苏木素、PBS缓冲粉、柠檬酸缓冲液、鼠兔通用试剂盒、显色试剂盒

二、免疫组化实验原理

抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量。

三、免疫组化实验步骤

1、60℃烤片30~60 min；

2、切片脱蜡水化：先将切片置于二甲苯中10 min，2次。然后依次在100%，95%，85%和75%乙醇，每级放置5-10 min。再用蒸馏水浸洗5 min；

3、加入3%H2O2，室温10分钟以灭活内源性酶。PBS冲洗3 min x 3次；

4、热修复抗原：将切片浸入柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）,微波炉高火加热8min后拿出，冷却至室温。冷却后0.01M PBS（pH7.2~7.6）洗涤3 min x 3次；

5、血清封闭：切片滴加5%羊血清放入湿盒中，室温20min。PBS洗涤3min×3次；

6、孵育一抗：滴加适当稀释的一抗，对照组滴加等量PBS，4℃冰箱过夜；

7、孵育二抗：将载玻片从冰箱中取出，37℃温箱复温30min；用PBS冲洗5 min x 3次；滴加50~100μL二抗，37℃温箱孵育30 min；PBS冲洗5 min x 3次；

8、标记：滴加HRP标记链霉亲和素，37℃温箱孵育20 min；

9、DAB显色：将片子从温箱中取出，PBS冲洗5 min x 3次；滴加预制好的显色剂DAB工作液50~100μL，室温孵育1-5 min，镜下控制反应时间；

10、复染：将显色后的片子蒸馏水洗涤，浸泡于苏木素中复染1-3 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝；

11、脱水：各级酒精（60-100%）脱水，每级5 min；

12、透明：取出后置于二甲苯10 min，2次；

13、封片：中性树胶封片、显微镜观察。