冰冻切片详细操作步骤

冰冻切片操作步骤一：取材

要进行冰冻切片观察的组织，应尽可能采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化，影响后期染色分析结果。

冰冻切片的步骤二：速冻

1、将取好的组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2 cm）。

2、如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。

3、当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20 s组织即迅速冰结成块。

4、再制成冻块，使其可置入恒冷箱切片机冰冻切片。

5、若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。

冰冻切片的步骤三：固定

1、样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10 min让OCT胶浸透组织。

2、取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。

3、组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30 min。

冰冻切片的步骤四：切片

1、恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。

2、切片时，低温室内温度以-15℃~-20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。

3、切好后，室温放置30 min后，入4℃丙酮固定5-10 min，烘箱干燥20 min。PBS洗5 min×3。

4、进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5-10 min，消除内源性过氧化物酶的活性