Co-IP免疫共沉淀实操注意事项

免疫共沉淀是一种以抗体和抗原识别专一性为基础，用于研究蛋白质相互作用的经典方法。我们在进行实验的操作时要注意的有：

1、样品制备时要注意：细胞裂解要采用温和的裂解条件，避免破坏细胞内存在的蛋白间相互作用，裂解、洗涤时需使用非变性裂解液。此外，由于不同细胞裂解条件不一样，建议通过预实验来确定最佳条件。

2、抗体固定时要注意的是：抗体的选择十分重要，选经过 IP 验证的抗体，可以减少假阳性概率。同时，要注意抗体/缓冲液的比例，抗体稀释过度不利于后续抗原抗体结合；而抗体过多就不能完全沉降在固相基质上，残存于上清。操作时，为了避免损伤 beads，使用大口径或截短枪头进行加样。

3、免疫共沉淀操作时要注意的是：增加在洗脱之前的洗涤次数或在免疫共沉淀缓冲液中加入 Triton X-100 ，可以降低非特异性结合，以防止蛋白在阴性对照树脂实验样品中被检测到。

确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。

4、洗脱与检测时要注意的是：如后续需进行酶活或功能性分析，则需使用兼容下游检测的 Elution buffer 进行洗脱。对于交联剂结合的 beads，为了保持抗体偶联树脂的活性，应立即再生和存储树脂，保证抗体可以重复利用。