Co-IP免疫共沉淀实验常见问题及解决方法

Co-IP免疫共沉淀常见问题及解决方法：
一、实验结果高背景

原因1：制备样品中可能有不完全溶解的大的蛋白复合体

制备样品后进行短暂超声处理（3次，每次5秒钟），然后离心纯化，取上清后进行后续实验

原因2：洗涤不彻底

多次洗涤，并逐渐增加洗涤缓冲液中的NaCl和去垢剂浓度

原因3：非特异性蛋白吸附于珠子上

进行Preclearing以排除非特异性吸附

原因4：抗体本身特异性不好

选择合适的抗体，可以考虑单抗

原因5：使用了太多的抗体

进行条件优化减少抗体

原因6：使用了过多的细胞或组织进行裂解

减少样本量，我们推荐100-500μg细胞裂解物

原因7：抗原降解

保证样品中加入了蛋白酶/磷酸酶抑制剂，尽量使用新鲜制备的样品

原因8：WB步骤出现错误或不规范

使用规范的WB,注意封闭、一二抗稀释的条件

二、无信号

原因1：目的蛋白在样本中表达量低或者不表达

首先对目的蛋白表达量进行检测，或者加大IP中加入的蛋白裂解物并进行预处理。

胞内蛋白互作的水平较低或没有互作，增加蛋白裂解物或进行诱导处理。

原因2：细胞裂解液使用不当

根据实验需要选择，慎重考虑。

原因3：目的蛋白未被洗脱

保证使用合适的洗脱液，保证洗脱液的强度和pH值合适。

原因4：抗体没有很好的与珠子相互结合

选择合适的珠子。

原因5：抗体选择不当或者不工作

利用WB对抗体进行验证

原因6：抗体使用不足