细胞培养的一般技术

促细胞分裂剂激活单核细胞

基本原理 ：

本方法是通过促细胞分裂剂与细胞表面受体相互作用，在体外触发细胞的多克隆激活。根据所使用的促细胞分裂剂的不同，应答细胞可以是T淋巴细胞、B淋巴细胞，或两者同时，或者是单核细胞。 细胞激活可以通过细胞增殖、细胞因子分泌、表面抗原表达和/或细胞体积的增加进行检测。例如在使用B细胞激活剂时，可以通过多克隆免疫球蛋白的分泌进行检测。

表1 常用的促细胞分裂剂和多克隆淋巴细胞激活剂

试剂和设备：

l 细胞悬浮液；

l 96孔平底组织培养板；

l 含血清培养基（通常为 RPMI 1640,含10% 胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素）；

l 促细胞分裂剂（见表1），要求纯品或半纯品，有市售商品；

l 多通道移液器和微量移液器；

l 带570nm滤片的酶标仪；

l 超净工作台；

l CO2 孵箱；

l 冷冻离心机。

操作步骤：

（一） 促细胞分裂剂制备

根据说明书将促细胞分裂剂重新溶解于水或培养液中，制成储存液（如100 ´ ），保存于-20℃。

（二） 促细胞分裂剂滴定

1．在培养液中稀释储存液到所需的第一个浓度，通常为理论最佳浓度的10倍；

2．在培养板或试管中直接将促细胞分裂剂进行浓度递减系列稀释（100 μl/孔）；

3．每孔平行重复三次；

（三） 细胞激活

1． 分离外周血单核细胞；

2． 室温下用培养液300 ´ g离心10分钟，收集并洗涤细胞；

3． 计数细胞并将细胞在培养液中重新悬浮至106 细胞/ml，在培养板中每孔加入100μl；

4． 在5% CO2 水浴孵箱中37℃孵育（细胞增殖需2-3天；细胞因子测定测定6小时-2天；免疫球蛋白分泌测定需5-10天）；

（四）细胞激活定量测定方法

1． 细胞增殖检测方法采用MTT测定法；

2． 细胞因子分泌测定或使用市售商业化试剂盒；

3． 免疫球蛋白分泌测定采用ELISA检测

对照试验：

1． 阴性对照：不含促细胞分裂剂的培养液为对照组；

2． 促细胞分裂剂没有阳性对照。通常利用滴定曲线进行预试验确定促细胞分裂剂的最佳浓度以及最佳培养时间。

实验要点及说明：

1． 促细胞分裂剂的计量应答曲线通常为钟形，并且高浓度的促细胞分裂剂其效果较差；

2． 尽量避免细胞浓度过低，不要采用圆底培养板；

3． 抗CD3和抗TCR抗体可以用于T淋巴细胞激活；

4． 偶联到小珠上的抗免疫球蛋白抗体可以用于B淋巴细胞激活。

第一节 细胞冷冻和复苏

基本原理：

在长期的细胞培养过程中可能会出现微生物污染或基因型改变等情况，会导致具有优良特性细胞系的丢失。为防止这些细胞的丢失，细胞可以经快速冷冻并几乎无限期保存在非常低的温度下，如液氮（-176℃）。

试剂和设备：

l 冷冻液: 90%灭活血清+10%DMSO（或甘油），用0.45μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存；

l 培养液；

l 台盼蓝溶液（0.4%溶解于PBS）；

l 70%乙醇；

l 组织培养瓶；

l 15-50 ml 无菌圆锥底离心试管；

l 离心机；

l 血球计数板；

l 超净工作台；

l 光学显微镜；

l 37℃水浴；

l 冷冻管；

l -80℃冰箱；

l 液氮和液氮容器。

操作步骤：

（一）冷冻细胞

1． 收集对数生长期细胞；

2． 以25μl台盼蓝溶液稀释25μl细胞悬液；用血球计数板计数并计算细胞存活率（至少应该在90%以上）；

3． 细胞悬液在4℃ 条件下200 ´ g离心10分钟；

4． 将沉淀的细胞重新悬浮在冷冻液中（大约5 ´ 106 细胞/0.5 ml 冷冻液）；

5． 将细胞悬液加入到冷冻管中，每管0.5 ml；

6． 将冷冻管置于-80℃冰箱中；

7． 24小时后，将冷冻管移入液氮罐中；

8． 在记录本或电脑中记录下每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。

（二）细胞复苏

1． 将冷冻管迅速由液氮转入到37℃水浴中，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免任何污染，不定时搅拌加速解冻；

2． 当细胞完全解冻后，用含70%乙醇的纱布擦拭冷冻管消毒；

3． 将解冻后细胞转移到含4℃预平衡培养液的试管中；

4． 细胞悬液在4℃下200 ´ g离心10分钟；

5． 弃上清，将细胞重新悬浮在新鲜培养液中；

6． 将细胞转移到细胞培养瓶，CO2 孵箱中培养；

7． 是用倒置显微镜检查细胞存活率以及细胞密度，如果细胞密度过高，用培养液稀释至适宜浓度。

对照试验