细胞凋亡检测-流式细胞仪检测技术
一、固定细胞的染色方法 1)PI单染色法 方法一 1.收集细胞(1~5)×106个,500~1000r/min离心5min,弃去培养液。 2.3ml PBS洗一次。 3.离心去PBS,加入冰预冷的70%的乙醇固定,4℃,1h。 4.离心弃去固定液,3ml PBS重悬5min。 5.400目的筛网过滤1次,500~1000r/min离心5min,弃去PBS。 6.用1ml PI染液,4℃避光30min。 7.流式细胞仪检测:PI用氩离子激发荧光,激发光波波长为488nm,发射光波波长大于630nm,产生红色荧光,可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。 方法二 1.收集细胞(1×106个),500~1000r/min离心5min,弃去培养液。 2.1ml PBS/FCS洗一次。 3.500~1000r/min离心5min去PBS/FCS,加入500μl PBS/FCS和500μl的多聚甲醛固定液,轻轻混匀,在4℃下固定4min。 4.500~1000r/min离心5min弃去固定液,室温加入含0.2% Tween的PBS 1ml,37℃孵育15min。 5.1ml PBS/FCS洗3次,每次5min。 6.400目的筛网过滤1次。 7.500~1000r/min离心5min去PBS/FCS,用1.0ml PI染液,4℃避光至少30min。染色在24h之内皆可行,流式细胞仪分析。 2)调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析 1.离心收集细胞,PBS洗1~2次。 2.1%多聚甲醛低温下固定15min。 3.3ml PBS洗1次,70%乙醇固定,冰箱内放置1~3天。 4.PBS轻洗1次 5.细胞与TdT标记液37℃孵育,时间1~2h。 6.PBS轻洗1次。 7.细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。 8.含0.1% Triton-X 100的PBS轻洗1次。 4.500~1000r/min离心5min弃去固定液,室温加入含0.2% Tween的PBS 1ml,37℃孵育15min。 5.1ml PBS/FCS洗3次,每次5min。 6.400目的筛网过滤1次。 7.500~1000r/min离心5min去PBS/FCS,用1.0ml PI染液,4℃避光至少30min。染色在24h之内皆可行,流式细胞仪分析。
2)调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析1.离心收集细胞,PBS洗1~2次。2.1%多聚甲醛低温下固定15min。3.3ml PBS洗1次,70%乙醇固定,冰箱内放置1~3天。4.PBS轻洗1次5.细胞与TdT标记液37℃孵育,时间1~2h。6.PBS轻洗1次。7.细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。8.含0.1% Triton-X 100的PBS轻洗1次。9.1ml PBS(含5mg/ml PI, 0.1% RNase A)重悬。10. 流式细胞仪分析红色(PI)对绿色荧光(FITC)的地形图。3)ISNT的流式细胞仪分析1.离心收集细胞,PBS洗1~2次2.1%多聚甲醛低温下固定15min。3.3ml PBS洗1次,70%乙醇固定,冰箱内放置1~3天。4.PBS轻洗1次。5.2×105细胞与12.5μl的缺口平移缓冲液在15℃共孵育6h,每过15min振动1次。6.PBS轻洗1次。7.细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。8.含0.1% Triton-X 100的PBS轻洗1次。9.1ml PBS(含5mg/ml PI, 0.1% RNase A)重悬。10. 流式细胞仪分析红色(PI)对绿色荧光(FITC)的地形图。二、非固定细胞的染色方法1)Hoechst 33342/PI双染色法1.悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342,终浓度为1μg/ml;帖壁生长的细胞用含有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液,离心,弃上清,用1ml全培养液重悬细胞,加入Heochst 33342,终浓度为1μg/ml,37℃孵育7~10min。2.4℃ 500~1000r/min离心弃去染液。3.加入1.0ml PI染液,4℃避光染色15min。4.400目的筛网过滤1次。5.流式细胞仪分析。2)Annexin V/PI双染色法1.细胞收集:悬浮细胞直接收集10ml的离心管中,而帖壁细胞先用滴管轻轻吹打,调亡细胞一经吹打可能脱壁,收集到10ml的离心管中,没脱壁的细胞用0.02%的EDTA消化使之脱壁,每样本细胞数为(1~5)×106,500~1000r/min离心5min弃去培养液。2.用孵育缓冲液洗1次,500~1000r/min离心5min。3.用100μl的标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育10~15min。4.500~1000r/min离心5min沉淀细胞,孵育缓冲液洗1次。5.加入荧光溶液4℃下孵育20min,避光并不时振动。