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细胞技术

CaCl2感受态细胞的制备

2025-03-01 细胞技术 加入收藏
试剂准备: LB培养基,50mL离心管4个,250mL摇瓶1个,1.5mL 离心管高压灭菌 0.1M CaCl2高压灭菌 含15%甘油的0.1M CaCl2:5
试剂准备: LB培养基,50mL离心管4个,250mL摇瓶1个,1.5mL 离心管高压灭菌 0.1M CaCl2高压灭菌 含15%甘油的0.1M CaCl2:50%甘油、0.15M CaCl2高压灭菌,1:2混合配制

制备步骤:

1.前夜接种受体菌(DH5α或DH10B),挑取单菌落(或直接用-80℃保存的单克隆菌液100μL), 放入10mL LB培养基中37℃摇床培养过夜(约12~16小时);

2.取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中,在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时(250-300rpm),检测OD550在0.6时最佳 (当OD550 在0.2时每20分钟检测一次);

3.将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷;

以下步骤需在超净工作台和冰上操作

4.将100mL菌液分装于4个50mL离心管,冰上冷却10min;

5.4℃下3000g冷冻离心5min;

6.弃去上清,加入10mL预冷0.1M CaCl2溶液,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮,在冰放置30min~60min;

7.4℃下3000g冷冻离心5min;

8.弃去上清,加入含15%甘油的预冷0.1M CaCl2溶液5mL,用移液枪轻轻上下吸动打匀,使细胞重新悬浮,100μL/管冰上分装至1.5mL 离心管中,封口并标记,-80℃贮存备用;

9.若直接用于转化实验,可不加甘油。 (责任编辑:大汉昆仑王)


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